DsbA-DsbA^mut fusion chaperon improved soluble expression of human trypsinogen-1 in Escherichia coli

Abstract

A co-expressing system of DsbA-DsbA^mut was suggested for the first time to enhance the soluble expression of human trypsin-1. As a control, leaderless DsbA chaperone was also co-expressed with human trypsin-1. Vectors pET39b-trypsin and pET28a-DsbA-DsbA^mut-trypsin with the above two DsbA fusion tag were constructed. The strain with vector pET39b-trypsin expressed fusion protein DsbA-trypsin in form of inclusion bodies. While in E. coli BL21 (DE3) strain with vector pET28a-DsbA-DsbA^mut-trypsin, the soluble expression of trypsin fusion protein was achieved. Under the optimized expression conditions, the soluble fraction accounted for about 49.43% of total DsbA-DsbA^mut-trypsin proteins in crude supernatant. The purification yield was 4.15% by nickel chelating chromatography and 3.3 mg activated trypsin with a purity of 88.68% was obtained from 1 L LB broth. To detect the possible functions of DsbA series chaperons in trypsin fusion protein, we analyzed the primary three-dimensional structure of fusion proteins, mainly focusing on the compatibleness between trypsin and fusion chaperons. The results suggested that (1) besides the primary function in periplasm, leaderless DsbA or DsbA^mut may also act as a signal sequences-like leader targeted to periplasm that partly relieved the pressure from fusion protein overexpression and inclusion body formation, and (2) as there was significant soluble expression of DsbA-DsbA^mut-trypsin compared with DsbA-trypsin, DsbA^mut may function as charge or hydrophobic balance in recombinant protein DsbA-DsbA^mut-trypsin.

Key words： DsbA; DsbA-DsbA^mut; soluble expression; trypsin; chaperon

Acknowledgements

The present work was partially supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31470967) and National Science and Technology Major Projects of China (Grant Nos. 2011ZX09201-301-05 and 2014ZX09508006-002-002).

References

1 Kemmler W. Peterson J D, Steiner D F. Studies on the conversion of proinsulin to insulin. I. Conversion in vitro with trypsin and Carboxypeptidase B. Journal of Biological Chemistry, 1971, 246(22): 6786–6791

2 Marcus-Sekura C, Richardson J C, Harston R K, Sane N, Sheets R L. Evaluation of the human host range of bovine and porcine viruses that may contaminate bovine serum and porcine trypsin used in the manufacture of biological products. Biologicals, 2011, 39(6): 359–369

3 Guy O, Lombardo D, Bartelt D C, Amic J, Figarella C. Two human trypsinogens. Purification, molecular properties, and N-terminal sequences. Biochemistry-US, 1978, 17(9): 1669–1675

4 Kukor Z, Toth M, Sahin-Toth M. Human anionic trypsinogen—Properties of autocatalytic activation and degradation and implications in pancreatic diseases. European Journal of Biochemistry, 2003, 270(9): 2047–2058

5 Kiraly O, Guan L, Szepessy E, Toth M, Kukor Z, Sahin-Toth M. Expression of human cationic trypsinogen with an authentic N-terminus using intein-mediated splicing in Aminopeptidase P deficient Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 2006, 48(1): 104–111

6 Chen J M, Kukor Z, Le Marechal U, Toth M, Tsakiris L, Raguenes O, Ferec C, Sahin-Toth M. Evolution of trypsinogen activation peptides. Molecular Biology and Evolution, 2003, 20(11): 1767–1777

7 Vasquez J R, Evnin L B, Higaki J N, Craik C S. An expression system for trypsin. Journal of Cellular Biochemistry, 1989, 39(3): 265–276

8 Szilagyi L, Kenesi E, Katona G, Kaslik G, Juhasz G, Graf L. Comparative in vitro studies on native and recombinant human cationic trypsins. Cathepsin B is a possible pathological activator of trypsinogen in pancreatitis. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(27): 24574–24580

9 Peterson F C, Gordon N C, Gettins P G. High-level bacterial expression and 15N-alanine-labeling of bovine trypsin. Application to the study of trypsin-inhibitor complexes and trypsinogen activation by NMR spectroscopy. Biochemistry, 2001, 40(21): 6275–6283

10 Hohenblum H, Vorauer-Uhl K, Katinger H, Mattanovich D. Bacterial expression and refolding of human trypsinogen. Journal of Biotechnology, 2004, 109(1−2): 3–11

11 Lichty J J, Malecki J L, Agnew H D, Michelson-Horowitz D J, Tan S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expression and Purification, 2005, 41(1): 98–105

12 Esposito D, Chatterjee D K. Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags. Current Opinion in Biotechnology, 2006, 17(4): 353–358

13 Bardwell J C, McGovern K, Beckwith J. Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo. Cell, 1991, 67(3): 581–589

14 Guddat L W, Bardwell J C A, Martin J L. Crystal structures of reduced and oxidized DsbA: Investigation of domain motion and thiolate stabilization. Structure, 1998, 6(6): 757–767

15 Schirra H J, Renner C, Czisch M, Huber-Wunderlich M, Holak T A, Glockshuber R. Structure of reduced DsbA from Escherichia coli in solution. Biochemistry, 1998, 37(18): 6263–6276

16 Zapun A, Bardwell J C, Creighton T E. <?Pub Caret1?>The reactive and destabilizing disulfide bond of DsbA, a protein required for protein disulfide bond formation in vivo. Biochemistry, 1993, 32(19): 5083–5092

17 Grauschopf U, Winther J R, Korber P, Zander T, Dallinger P, Bardwell J C. Why is DsbA such an oxidizing disulfide catalyst? Cell, 1995, 83(6): 947–955

18 Winter J, Neubauer P, Glockshuber R, Rudolph R. Increased production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by fusion to DsbA. Journal of Biotechnology, 2001, 84(2): 175–185

19 Dutta S, Ghosh R, Dattagupta J K, Biswas S. Heterologous expression of a thermostable plant cysteine protease in Escherichia coli both in soluble and insoluble forms. Process Biochemistry, 2010, 45(8): 1307–1312

20 Huang H, Gan Y R, Sun Y. Cloning and fusion expression of bovine enterokinase light chain gene in Escherichia coli. Hereditas, 2003, 25(6): 685–690

21 Kim B, Hyun Y J, Lee K S, Kobashi K, Kim D H. Cloning, expression and purification of arylsulfate sulfotransferase from Eubacterium A-44. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2007, 30(1): 11–14

22 Thorstenson Y R, Zhang Y, Olson P S, Mascarenhas D. Leaderless polypeptides efficiently extracted from whole cells by osmotic shock. Journal of Bacteriology, 1997, 179(17): 5333–5339

23 Zhang Y, Olsen D R, Nguyen K B, Olson P S, Rhodes E T, Mascarenhas D. Expression of eukaryotic proteins in soluble form in Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 1998, 12(2): 159–165

24 Schein C H, Noteborn M H M. Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coli is favored by lower growth temperature. Nature Biotechnology, 1988, 6(3): 291–294

25 Kopetzki E, Schumacher G, Buckel P. Control of formation of active soluble or inactive insoluble baker’s yeast alpha-glucosidase PI in Escherichia coli by induction and growth conditions. Molecular & General Genetics: MGG, 1989, 216(1): 149–155

26 Yang Q, Xu J, Li M, Lei X, An L. High-level expression of a soluble snake venom enzyme, gloshedobin, in E. coli in the presence of metal ions. Biotechnology Letters, 2003, 25(8): 607–610

27 Ling Z, Ma T, Li J, Du G, Kang Z, Chen J. Functional expression of trypsin from Streptomyces griseus by Pichia pastoris. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012, 39(11): 1651–1662

28 Guex N, Peitsch M C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. Electrophoresis, 1997, 18(15): 2714–2723

29 Thaker Y R, Roessle M, Gruber G. The boxing glove shape of subunit d of the yeast V-ATPase in solution and the importance of disulfide formation for folding of this protein. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 2007, 39(4): 275–289

30 Diaz A A, Tomba E, Lennarson R, Richard R, Bagajewicz M J, Harrison R G. Prediction of protein solubility in Escherichia coli using logistic regression. Biotechnology and Bioengineering, 2010, 105(2): 374–383

31 Wilkinson D L, Harrison R G. Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Bio/Technology, 1991, 9(5): 443–448

32 Shao S, Yu R, Yu Y, Li Y. Dual-inhibitors of STAT5 and STAT3: Studies from molecular docking and molecular dynamics simulations. Journal of Molecular Modeling, 2014, 20(8): 2399

33 Shi C, Yu R, Shao S, Li Y. Partial activation of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors: Insights from molecular dynamics simulations. Journal of Molecular Modeling, 2013, 19(2): 871–878

34 Sommaruga S, De Palma A, Mauri P L, Trisciani M, Basilico F, Martelli P L, Casadio R, Tortora P, Occhipinti E. A combined approach of mass spectrometry, molecular modeling, and site-directed mutagenesis highlights key structural features responsible for the thermostability of Sulfolobus solfataricus carboxypeptidase. Proteins, 2008, 71(4): 1843–1852

35 Ewalt K L, Hendrick J P, Houry W A, Hartl F U. In vivo observation of polypeptide flux through the bacterial chaperonin system. Cell, 1997, 90(3): 491–500

36 Baneyx F, Mujacic M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnology, 2004, 22(11): 1399–1408

37 Couture M M, Auger M, Rosell F, Mauk A G, Boubour E, Lennox R B, Eltis L D. Investigation of the role of a surface patch in the self-association of Chromatium vinosum high potential iron-sulfur protein. Biochimica et Biophysica Acta, 1999, 1433(1−2): 159–169

38 Rezaei-Ghaleh N, Ramshini H, Ebrahim-Habibi A, Moosavi-Movahedi A A, Nemat-Gorgani M. Thermal aggregation of alpha-chymotrypsin: Role of hydrophobic and electrostatic interactions. Biophysical Chemistry, 2008, 132(1): 23–32

39 Kumarevel T S, Gromiha M M, Ponnuswamy M N. Analysis of hydrophobic and charged patches and influence of medium- and long-range interactions in molecular chaperones. Biophysical Chemistry, 1998, 75(2): 105–113

40 Neupert W, Hartl F U, Craig E A, Pfanner N. How do polypeptides cross the mitochondrial membranes? Cell, 1990, 63(3): 447–450

41 Flynn G C, Pohl J, Flocco M T, Rothman J E. Peptide-binding specificity of the molecular chaperone BiP. Nature, 1991, 353(6346): 726–730

42 Richarme G, Kohiyama M. Specificity of the Escherichia coli chaperone DnaK (70-kDa heat shock protein) for hydrophobic amino acids. Journal of Biological Chemistry, 1993, 268(32): 24074–24077

43 Zbilut J P, Mitchell J C, Giuliani A, Colosimo A, Marwan N, Webber C L. Singular hydrophobicity patterns and net charge: A mesoscopic principle for protein aggregation/folding. Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 2004, 343: 348–358