DsbA-DsbA^mut fusion chaperon improved soluble expression of human trypsinogen-1 in Escherichia coli

Abstract

A co-expressing system of DsbA-DsbA^mut was suggested for the first time to enhance the soluble expression of human trypsin-1. As a control, leaderless DsbA chaperone was also co-expressed with human trypsin-1. Vectors pET39b-trypsin and pET28a-DsbA-DsbA^mut-trypsin with the above two DsbA fusion tag were constructed. The strain with vector pET39b-trypsin expressed fusion protein DsbA-trypsin in form of inclusion bodies. While in E. coli BL21 (DE3) strain with vector pET28a-DsbA-DsbA^mut-trypsin, the soluble expression of trypsin fusion protein was achieved. Under the optimized expression conditions, the soluble fraction accounted for about 49.43% of total DsbA-DsbA^mut-trypsin proteins in crude supernatant. The purification yield was 4.15% by nickel chelating chromatography and 3.3 mg activated trypsin with a purity of 88.68% was obtained from 1 L LB broth. To detect the possible functions of DsbA series chaperons in trypsin fusion protein, we analyzed the primary three-dimensional structure of fusion proteins, mainly focusing on the compatibleness between trypsin and fusion chaperons. The results suggested that (1) besides the primary function in periplasm, leaderless DsbA or DsbA^mut may also act as a signal sequences-like leader targeted to periplasm that partly relieved the pressure from fusion protein overexpression and inclusion body formation, and (2) as there was significant soluble expression of DsbA-DsbA^mut-trypsin compared with DsbA-trypsin, DsbA^mut may function as charge or hydrophobic balance in recombinant protein DsbA-DsbA^mut-trypsin.

Graphical abstract

Keywords

DsbA / DsbA-DsbA^mut / soluble expression / trypsin / chaperon

References

[1] Kemmler W. Peterson J D, Steiner D F. Studies on the conversion of proinsulin to insulin. I. Conversion in vitro with trypsin and Carboxypeptidase B. Journal of Biological Chemistry, 1971, 246(22): 6786–6791

[2] Marcus-Sekura C, Richardson J C, Harston R K, Sane N, Sheets R L. Evaluation of the human host range of bovine and porcine viruses that may contaminate bovine serum and porcine trypsin used in the manufacture of biological products. Biologicals, 2011, 39(6): 359–369

[3] Guy O, Lombardo D, Bartelt D C, Amic J, Figarella C. Two human trypsinogens. Purification, molecular properties, and N-terminal sequences. Biochemistry-US, 1978, 17(9): 1669–1675

[4] Kukor Z, Toth M, Sahin-Toth M. Human anionic trypsinogen—Properties of autocatalytic activation and degradation and implications in pancreatic diseases. European Journal of Biochemistry, 2003, 270(9): 2047–2058

[5] Kiraly O, Guan L, Szepessy E, Toth M, Kukor Z, Sahin-Toth M. Expression of human cationic trypsinogen with an authentic N-terminus using intein-mediated splicing in Aminopeptidase P deficient Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 2006, 48(1): 104–111

[6] Chen J M, Kukor Z, Le Marechal U, Toth M, Tsakiris L, Raguenes O, Ferec C, Sahin-Toth M. Evolution of trypsinogen activation peptides. Molecular Biology and Evolution, 2003, 20(11): 1767–1777

[7] Vasquez J R, Evnin L B, Higaki J N, Craik C S. An expression system for trypsin. Journal of Cellular Biochemistry, 1989, 39(3): 265–276

[8] Szilagyi L, Kenesi E, Katona G, Kaslik G, Juhasz G, Graf L. Comparative in vitro studies on native and recombinant human cationic trypsins. Cathepsin B is a possible pathological activator of trypsinogen in pancreatitis. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(27): 24574–24580

[9] Peterson F C, Gordon N C, Gettins P G. High-level bacterial expression and 15N-alanine-labeling of bovine trypsin. Application to the study of trypsin-inhibitor complexes and trypsinogen activation by NMR spectroscopy. Biochemistry, 2001, 40(21): 6275–6283

[10] Hohenblum H, Vorauer-Uhl K, Katinger H, Mattanovich D. Bacterial expression and refolding of human trypsinogen. Journal of Biotechnology, 2004, 109(1−2): 3–11

[11] Lichty J J, Malecki J L, Agnew H D, Michelson-Horowitz D J, Tan S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expression and Purification, 2005, 41(1): 98–105

[12] Esposito D, Chatterjee D K. Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags. Current Opinion in Biotechnology, 2006, 17(4): 353–358

[13] Bardwell J C, McGovern K, Beckwith J. Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo. Cell, 1991, 67(3): 581–589

[14] Guddat L W, Bardwell J C A, Martin J L. Crystal structures of reduced and oxidized DsbA: Investigation of domain motion and thiolate stabilization. Structure, 1998, 6(6): 757–767

[15] Schirra H J, Renner C, Czisch M, Huber-Wunderlich M, Holak T A, Glockshuber R. Structure of reduced DsbA from Escherichia coli in solution. Biochemistry, 1998, 37(18): 6263–6276

[16] Zapun A, Bardwell J C, Creighton T E. <?Pub Caret1?>The reactive and destabilizing disulfide bond of DsbA, a protein required for protein disulfide bond formation in vivo. Biochemistry, 1993, 32(19): 5083–5092

[17] Grauschopf U, Winther J R, Korber P, Zander T, Dallinger P, Bardwell J C. Why is DsbA such an oxidizing disulfide catalyst? Cell, 1995, 83(6): 947–955

[18] Winter J, Neubauer P, Glockshuber R, Rudolph R. Increased production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by fusion to DsbA. Journal of Biotechnology, 2001, 84(2): 175–185

[19] Dutta S, Ghosh R, Dattagupta J K, Biswas S. Heterologous expression of a thermostable plant cysteine protease in Escherichia coli both in soluble and insoluble forms. Process Biochemistry, 2010, 45(8): 1307–1312

[20] Huang H, Gan Y R, Sun Y. Cloning and fusion expression of bovine enterokinase light chain gene in Escherichia coli. Hereditas, 2003, 25(6): 685–690

[21] Kim B, Hyun Y J, Lee K S, Kobashi K, Kim D H. Cloning, expression and purification of arylsulfate sulfotransferase from Eubacterium A-44. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2007, 30(1): 11–14

[22] Thorstenson Y R, Zhang Y, Olson P S, Mascarenhas D. Leaderless polypeptides efficiently extracted from whole cells by osmotic shock. Journal of Bacteriology, 1997, 179(17): 5333–5339

[23] Zhang Y, Olsen D R, Nguyen K B, Olson P S, Rhodes E T, Mascarenhas D. Expression of eukaryotic proteins in soluble form in Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 1998, 12(2): 159–165

[24] Schein C H, Noteborn M H M. Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coli is favored by lower growth temperature. Nature Biotechnology, 1988, 6(3): 291–294

[25] Kopetzki E, Schumacher G, Buckel P. Control of formation of active soluble or inactive insoluble baker’s yeast alpha-glucosidase PI in Escherichia coli by induction and growth conditions. Molecular & General Genetics: MGG, 1989, 216(1): 149–155

[26] Yang Q, Xu J, Li M, Lei X, An L. High-level expression of a soluble snake venom enzyme, gloshedobin, in E. coli in the presence of metal ions. Biotechnology Letters, 2003, 25(8): 607–610

[27] Ling Z, Ma T, Li J, Du G, Kang Z, Chen J. Functional expression of trypsin from Streptomyces griseus by Pichia pastoris. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012, 39(11): 1651–1662

[28] Guex N, Peitsch M C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. Electrophoresis, 1997, 18(15): 2714–2723

[29] Thaker Y R, Roessle M, Gruber G. The boxing glove shape of subunit d of the yeast V-ATPase in solution and the importance of disulfide formation for folding of this protein. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 2007, 39(4): 275–289

[30] Diaz A A, Tomba E, Lennarson R, Richard R, Bagajewicz M J, Harrison R G. Prediction of protein solubility in Escherichia coli using logistic regression. Biotechnology and Bioengineering, 2010, 105(2): 374–383

[31] Wilkinson D L, Harrison R G. Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Bio/Technology, 1991, 9(5): 443–448

[32] Shao S, Yu R, Yu Y, Li Y. Dual-inhibitors of STAT5 and STAT3: Studies from molecular docking and molecular dynamics simulations. Journal of Molecular Modeling, 2014, 20(8): 2399

[33] Shi C, Yu R, Shao S, Li Y. Partial activation of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors: Insights from molecular dynamics simulations. Journal of Molecular Modeling, 2013, 19(2): 871–878

[34] Sommaruga S, De Palma A, Mauri P L, Trisciani M, Basilico F, Martelli P L, Casadio R, Tortora P, Occhipinti E. A combined approach of mass spectrometry, molecular modeling, and site-directed mutagenesis highlights key structural features responsible for the thermostability of Sulfolobus solfataricus carboxypeptidase. Proteins, 2008, 71(4): 1843–1852

[35] Ewalt K L, Hendrick J P, Houry W A, Hartl F U. In vivo observation of polypeptide flux through the bacterial chaperonin system. Cell, 1997, 90(3): 491–500

[36] Baneyx F, Mujacic M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnology, 2004, 22(11): 1399–1408

[37] Couture M M, Auger M, Rosell F, Mauk A G, Boubour E, Lennox R B, Eltis L D. Investigation of the role of a surface patch in the self-association of Chromatium vinosum high potential iron-sulfur protein. Biochimica et Biophysica Acta, 1999, 1433(1−2): 159–169

[38] Rezaei-Ghaleh N, Ramshini H, Ebrahim-Habibi A, Moosavi-Movahedi A A, Nemat-Gorgani M. Thermal aggregation of alpha-chymotrypsin: Role of hydrophobic and electrostatic interactions. Biophysical Chemistry, 2008, 132(1): 23–32

[39] Kumarevel T S, Gromiha M M, Ponnuswamy M N. Analysis of hydrophobic and charged patches and influence of medium- and long-range interactions in molecular chaperones. Biophysical Chemistry, 1998, 75(2): 105–113

[40] Neupert W, Hartl F U, Craig E A, Pfanner N. How do polypeptides cross the mitochondrial membranes? Cell, 1990, 63(3): 447–450

[41] Flynn G C, Pohl J, Flocco M T, Rothman J E. Peptide-binding specificity of the molecular chaperone BiP. Nature, 1991, 353(6346): 726–730

[42] Richarme G, Kohiyama M. Specificity of the Escherichia coli chaperone DnaK (70-kDa heat shock protein) for hydrophobic amino acids. Journal of Biological Chemistry, 1993, 268(32): 24074–24077

[43] Zbilut J P, Mitchell J C, Giuliani A, Colosimo A, Marwan N, Webber C L. Singular hydrophobicity patterns and net charge: A mesoscopic principle for protein aggregation/folding. Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 2004, 343: 348–358

Acknowledgements

The present work was partially supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31470967) and National Science and Technology Major Projects of China (Grant Nos. 2011ZX09201-301-05 and 2014ZX09508006-002-002).

RIGHTS & PERMISSIONS

2014 Higher Education Press and Springer-Verlag Berlin Heidelberg