DsbA-DsbA^mut fusion chaperon improved soluble expression of human trypsinogen-1 in Escherichia coli

Abstract

A co-expressing system of DsbA-DsbA^mut was suggested for the first time to enhance the soluble expression of human trypsin-1. As a control, leaderless DsbA chaperone was also co-expressed with human trypsin-1. Vectors pET39b-trypsin and pET28a-DsbA-DsbA^mut-trypsin with the above two DsbA fusion tag were constructed. The strain with vector pET39b-trypsin expressed fusion protein DsbA-trypsin in form of inclusion bodies. While in E. coli BL21 (DE3) strain with vector pET28a-DsbA-DsbA^mut-trypsin, the soluble expression of trypsin fusion protein was achieved. Under the optimized expression conditions, the soluble fraction accounted for about 49.43% of total DsbA-DsbA^mut-trypsin proteins in crude supernatant. The purification yield was 4.15% by nickel chelating chromatography and 3.3 mg activated trypsin with a purity of 88.68% was obtained from 1 L LB broth. To detect the possible functions of DsbA series chaperons in trypsin fusion protein, we analyzed the primary three-dimensional structure of fusion proteins, mainly focusing on the compatibleness between trypsin and fusion chaperons. The results suggested that (1) besides the primary function in periplasm, leaderless DsbA or DsbA^mut may also act as a signal sequences-like leader targeted to periplasm that partly relieved the pressure from fusion protein overexpression and inclusion body formation, and (2) as there was significant soluble expression of DsbA-DsbA^mut-trypsin compared with DsbA-trypsin, DsbA^mut may function as charge or hydrophobic balance in recombinant protein DsbA-DsbA^mut-trypsin.

Graphical abstract

Keywords

DsbA / DsbA-DsbA^mut / soluble expression / trypsin / chaperon

References

[1] Kemmler W. Peterson J D, Steiner D F. Studies on the conversion of proinsulin to insulin. I. Conversion in vitro with trypsin and Carboxypeptidase B. Journal of Biological Chemistry, 1971, 246(22): 6786–6791

[2] Marcus-Sekura C, Richardson J C, Harston R K, Sane N, Sheets R L. Evaluation of the human host range of bovine and porcine viruses that may contaminate bovine serum and porcine trypsin used in the manufacture of biological products. Biologicals, 2011, 39(6): 359–369

[3] Guy O, Lombardo D, Bartelt D C, Amic J, Figarella C. Two human trypsinogens. Purification, molecular properties, and N-terminal sequences. Biochemistry-US, 1978, 17(9): 1669–1675

[4] Kukor Z, Toth M, Sahin-Toth M. Human anionic trypsinogen—Properties of autocatalytic activation and degradation and implications in pancreatic diseases. European Journal of Biochemistry, 2003, 270(9): 2047–2058

[5] Kiraly O, Guan L, Szepessy E, Toth M, Kukor Z, Sahin-Toth M. Expression of human cationic trypsinogen with an authentic N-terminus using intein-mediated splicing in Aminopeptidase P deficient Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 2006, 48(1): 104–111

[6] Chen J M, Kukor Z, Le Marechal U, Toth M, Tsakiris L, Raguenes O, Ferec C, Sahin-Toth M. Evolution of trypsinogen activation peptides. Molecular Biology and Evolution, 2003, 20(11): 1767–1777

[7] Vasquez J R, Evnin L B, Higaki J N, Craik C S. An expression system for trypsin. Journal of Cellular Biochemistry, 1989, 39(3): 265–276

[8] Szilagyi L, Kenesi E, Katona G, Kaslik G, Juhasz G, Graf L. Comparative in vitro studies on native and recombinant human cationic trypsins. Cathepsin B is a possible pathological activator of trypsinogen in pancreatitis. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(27): 24574–24580

[9] Peterson F C, Gordon N C, Gettins P G. High-level bacterial expression and 15N-alanine-labeling of bovine trypsin. Application to the study of trypsin-inhibitor complexes and trypsinogen activation by NMR spectroscopy. Biochemistry, 2001, 40(21): 6275–6283

[10] Hohenblum H, Vorauer-Uhl K, Katinger H, Mattanovich D. Bacterial expression and refolding of human trypsinogen. Journal of Biotechnology, 2004, 109(1−2): 3–11

[11] Lichty J J, Malecki J L, Agnew H D, Michelson-Horowitz D J, Tan S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expression and Purification, 2005, 41(1): 98–105

[12] Esposito D, Chatterjee D K. Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags. Current Opinion in Biotechnology, 2006, 17(4): 353–358

[13] Bardwell J C, McGovern K, Beckwith J. Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo. Cell, 1991, 67(3): 581–589

[14] Guddat L W, Bardwell J C A, Martin J L. Crystal structures of reduced and oxidized DsbA: Investigation of domain motion and thiolate stabilization. Structure, 1998, 6(6): 757–767

[15] Schirra H J, Renner C, Czisch M, Huber-Wunderlich M, Holak T A, Glockshuber R. Structure of reduced DsbA from Escherichia coli in solution. Biochemistry, 1998, 37(18): 6263–6276

[16] Zapun A, Bardwell J C, Creighton T E. <?Pub Caret1?>The reactive and destabilizing disulfide bond of DsbA, a protein required for protein disulfide bond formation in vivo. Biochemistry, 1993, 32(19): 5083–5092

[17] Grauschopf U, Winther J R, Korber P, Zander T, Dallinger P, Bardwell J C. Why is DsbA such an oxidizing disulfide catalyst? Cell, 1995, 83(6): 947–955

[18] Winter J, Neubauer P, Glockshuber R, Rudolph R. Increased production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by fusion to DsbA. Journal of Biotechnology, 2001, 84(2): 175–185

[19] Dutta S, Ghosh R, Dattagupta J K, Biswas S. Heterologous expression of a thermostable plant cysteine protease in Escherichia coli both in soluble and insoluble forms. Process Biochemistry, 2010, 45(8): 1307–1312

[20] Huang H, Gan Y R, Sun Y. Cloning and fusion expression of bovine enterokinase light chain gene in Escherichia coli. Hereditas, 2003, 25(6): 685–690

[21] Kim B, Hyun Y J, Lee K S, Kobashi K, Kim D H. Cloning, expression and purification of arylsulfate sulfotransferase from Eubacterium A-44. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2007, 30(1): 11–14

[22] Thorstenson Y R, Zhang Y, Olson P S, Mascarenhas D. Leaderless polypeptides efficiently extracted from whole cells by osmotic shock. Journal of Bacteriology, 1997, 179(17): 5333–5339

[23] Zhang Y, Olsen D R, Nguyen K B, Olson P S, Rhodes E T, Mascarenhas D. Expression of eukaryotic proteins in soluble form in Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 1998, 12(2): 159–165

[24] Schein C H, Noteborn M H M. Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coli is favored by lower growth temperature. Nature Biotechnology, 1988, 6(3): 291–294

[25] Kopetzki E, Schumacher G, Buckel P. Control of formation of active soluble or inactive insoluble baker’s yeast alpha-glucosidase PI in Escherichia coli by induction and growth conditions. Molecular & General Genetics: MGG, 1989, 216(1): 149–155

[26] Yang Q, Xu J, Li M, Lei X, An L. High-level expression of a soluble snake venom enzyme, gloshedobin, in E. coli in the presence of metal ions. Biotechnology Letters, 2003, 25(8): 607–610

[27] Ling Z, Ma T, Li J, Du G, Kang Z, Chen J. Functional expression of trypsin from Streptomyces griseus by Pichia pastoris. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012, 39(11): 1651–1662

[28] Guex N, Peitsch M C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. Electrophoresis, 1997, 18(15): 2714–2723

[29] Thaker Y R, Roessle M, Gruber G. The boxing glove shape of subunit d of the yeast V-ATPase in solution and the importance of disulfide formation for folding of this protein. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 2007, 39(4): 275–289

[30] Diaz A A, Tomba E, Lennarson R, Richard R, Bagajewicz M J, Harrison R G. Prediction of protein solubility in Escherichia coli using logistic regression. Biotechnology and Bioengineering, 2010, 105(2): 374–383

[31] Wilkinson D L, Harrison R G. Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Bio/Technology, 1991, 9(5): 443–448

[32] Shao S, Yu R, Yu Y, Li Y. Dual-inhibitors of STAT5 and STAT3: Studies from molecular docking and molecular dynamics simulations. Journal of Molecular Modeling, 2014, 20(8): 2399

[33] Shi C, Yu R, Shao S, Li Y. Partial activation of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors: Insights from molecular dynamics simulations. Journal of Molecular Modeling, 2013, 19(2): 871–878

[34] Sommaruga S, De Palma A, Mauri P L, Trisciani M, Basilico F, Martelli P L, Casadio R, Tortora P, Occhipinti E. A combined approach of mass spectrometry, molecular modeling, and site-directed mutagenesis highlights key structural features responsible for the thermostability of Sulfolobus solfataricus carboxypeptidase. Proteins, 2008, 71(4): 1843–1852

[35] Ewalt K L, Hendrick J P, Houry W A, Hartl F U. In vivo observation of polypeptide flux through the bacterial chaperonin system. Cell, 1997, 90(3): 491–500

[36] Baneyx F, Mujacic M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnology, 2004, 22(11): 1399–1408

[37] Couture M M, Auger M, Rosell F, Mauk A G, Boubour E, Lennox R B, Eltis L D. Investigation of the role of a surface patch in the self-association of Chromatium vinosum high potential iron-sulfur protein. Biochimica et Biophysica Acta, 1999, 1433(1−2): 159–169

[38] Rezaei-Ghaleh N, Ramshini H, Ebrahim-Habibi A, Moosavi-Movahedi A A, Nemat-Gorgani M. Thermal aggregation of alpha-chymotrypsin: Role of hydrophobic and electrostatic interactions. Biophysical Chemistry, 2008, 132(1): 23–32

[39] Kumarevel T S, Gromiha M M, Ponnuswamy M N. Analysis of hydrophobic and charged patches and influence of medium- and long-range interactions in molecular chaperones. Biophysical Chemistry, 1998, 75(2): 105–113

[40] Neupert W, Hartl F U, Craig E A, Pfanner N. How do polypeptides cross the mitochondrial membranes? Cell, 1990, 63(3): 447–450

[41] Flynn G C, Pohl J, Flocco M T, Rothman J E. Peptide-binding specificity of the molecular chaperone BiP. Nature, 1991, 353(6346): 726–730

[42] Richarme G, Kohiyama M. Specificity of the Escherichia coli chaperone DnaK (70-kDa heat shock protein) for hydrophobic amino acids. Journal of Biological Chemistry, 1993, 268(32): 24074–24077

[43] Zbilut J P, Mitchell J C, Giuliani A, Colosimo A, Marwan N, Webber C L. Singular hydrophobicity patterns and net charge: A mesoscopic principle for protein aggregation/folding. Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 2004, 343: 348–358

RIGHTS & PERMISSIONS

Higher Education Press and Springer-Verlag Berlin Heidelberg