Generation of CRISPR/Cas9-mediated lactoferrin-targeted mice by pronuclear injection of plasmid pX330

Abstract

Lactoferrin is a member of the transferrin family of multifunctional iron binding glycoproteins. While numerous physiological functions have been described for lactoferrin, the mechanisms underlying these functions are not clear. To further study the functions and mechanisms of lactoferrin, we modified the lactoferrin promoter of mice using the CRISPR/Cas9 system to reduce or eliminate lactoferrin expression. Seven mice with lactoferrin promoter mutations were obtained with an efficiency of 24% (7/29) by injecting the plasmid pX330, expressing a small guide RNA and human codon-optimized SpCas9, into fertilized eggs of mice. Plasmid integration and off-targeting of pX330 were not detected. These results confirmed that pronuclear injection of a circular plasmid is a feasible and efficient method for targeted mutagenesis in mice.

Keywords

lactoferrin / promoter / CRISPR/Cas9 / plasmid pX330

References

[1] Sorensen M, Sorensen S. The proteins in whey. Compte rendu des Travaux du Laboratoire de Carlsberg Ser Chim, 1940, 23(7): 55–99

[2] Groves M L. The isolation of a red protein from milk. Journal of the American Chemical Society, 1960, 82(13): 3345–3350

[3] Johanson B, Virtanen A I, Tweit R C, Dodson R M. Isolation of an iron-containing red protein from human milk. Acta Chemica Scandinavica, 1960, 14(2): 510–512

[4] Montreuil J, Tonnelat J, Mullet S. Preparation and properties of lactosiderophilin (lactotransferrin) of human milk. Biochimica et Biophysica Acta, 1960, 45: 413–421

[5] Actor J K, Hwang S A, Kruzel M L. Lactoferrin as a natural immune modulator. Current Pharmaceutical Design, 2009, 15(17): 1956–1973

[6] Ward P P, Conneely O M. Lactoferrin: role in iron homeostasis and host defense against microbial infection. Biometals, 2004, 17(3): 203–208

[7] Blais A, Malet A, Mikogami T, Martin-Rouas C, Tomé D. Oral bovine lactoferrin improves bone status of ovariectomized mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism, 2009, 296(6): E1281–E1288

[8] Malet A, Bournaud E, Lan A, Mikogami T, Tomé D, Blais A. Bovine lactoferrin improves bone status of ovariectomized mice via immune function modulation. Bone, 2011, 48(5): 1028–1035

[9] Mulder A M, Connellan P A, Oliver C J, Morris C A, Stevenson L M. Bovine lactoferrin supplementation supports immune and antioxidant status in healthy human males. Nutrition Research, 2008, 28(9): 583–589

[10] Wang Y Z, Shan T Z, Xu Z R, Feng J, Wang Z Q. Effects of the lactoferrin (LF) on the growth performance, intestinal microflora and morphology of weanling pigs. Animal Feed Science and Technology, 2007, 135(3): 263–272

[11] Velusamy S K, Ganeshnarayan K, Markowitz K, Schreiner H, Furgang D, Fine D H, Velliyagounder K. Lactoferrin knockout mice demonstrates greater susceptibility to Aggregatibacter actinomycetemcomitans–induced periodontal disease. Journal of Periodontology, 2013, 84(11): 1690–1701

[12] van der Strate B W, Beljaars L, Molema G, Harmsen M C, Meijer D K. Antiviral activities of lactoferrin. Antiviral Research, 2001, 52(3): 225–239

[13] Farnaud S, Evans R W. Lactoferrin—a multifunctional protein with antimicrobial properties. Molecular Immunology, 2003, 40(7): 395–405

[14] Yang N, Strøm M B, Mekonnen S M, Svendsen J S, Rekdal O. The effects of shortening lactoferrin derived peptides against tumour cells, bacteria and normal human cells. Journal of Peptide Science, 2004, 10(1): 37–46

[15] Garneau J E, Dupuis M È, Villion M, Romero D A, Barrangou R, Boyaval P, Fremaux C, Horvath P, Magadán A H, Moineau S. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature, 2010, 468(7320): 67–71

[16] Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(39): E2579–E2586

[17] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna J A, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012, 337(6096): 816–821

[18] Mussolino C, Cathomen T. RNA guides genome engineering. Nature Biotechnology, 2013, 31(3): 208–209

[19] Cho S W, Kim S, Kim J M, Kim J S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology, 2013, 31(3): 230–232

[20] Shen B, Zhang J, Wu H, Wang J, Ma K, Li Z, Zhang X, Zhang P, Huang X. Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research, 2013, 23(5): 720–723

[21] Hwang W Y, Fu Y, Reyon D, Maeder M L, Tsai S Q, Sander J D, Peterson R T, Yeh J R, Joung J K. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology, 2013, 31(3): 227–229

[22] Li W, Teng F, Li T, Zhou Q. Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology, 2013, 31(8): 684–686

[23] Niu Y, Shen B, Cui Y, Chen Y, Wang J, Wang L, Kang Y, Zhao X, Si W, Li W, Xiang A P, Zhou J, Guo X, Bi Y, Si C, Hu B, Dong G, Wang H, Zhou Z, Li T, Tan T, Pu X, Wang F, Ji S, Zhou Q, Huang X, Ji W, Sha J. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell, 2014, 156(4): 836–843

[24] Han H, Ma Y, Wang T, Lian L, Tian X, Hu R, Deng S, Li K, Wang F, Li N, Liu G, Zhao Y, Lian Z. One-step generation of myostatin gene knockout sheep via the CRISPR/Cas9 system. Frontiers of Agricultural Science and Engineering, 2014, 1(1): 2–5

[25] Liu Y H, Teng C T. Characterization of estrogen-responsive mouse lactoferrin promoter. Journal of Biological Chemistry, 1991, 266(32): 21880–21885

[26] Ramakrishna S, Cho S W, Kim S, Song M, Gopalappa R, Kim J S, Kim H. Surrogate reporter-based enrichment of cells containing RNA-guided Cas9 nuclease-induced mutations. Nature Communications, 2014, 5(3378): 3378

[27] Dejosez M, Krumenacker J S, Zitur L J, Passeri M, Chu L F, Songyang Z, Thomson J A, Zwaka T P. Ronin is essential for embryogenesis and the pluripotency of mouse embryonic stem cells. Cell, 2008, 133(7): 1162–1174

[28] Yang H, Wang H, Shivalila C S, Cheng A W, Shi L, Jaenisch R. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell, 2013, 154(6): 1370–1379

[29] Cong L, Ran F A, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu P D, Wu X, Jiang W, Marraffini L A, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013, 339(6121): 819–823

[30] Mashiko D, Fujihara Y, Satouh Y, Miyata H, Isotani A, Ikawa M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports, 2013, 3(3355): 3355

[31] Fu Y, Sander J D, Reyon D, Cascio V M, Joung J K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology, 2014, 32(3): 279–284

[32] Ran F A, Hsu P D, Lin C Y, Gootenberg J S, Konermann S, Trevino A E, Scott D A, Inoue A, Matoba S, Zhang Y, Zhang F. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell, 2013, 154(6): 1380–1389

[33] Tsai S Q, Wyvekens N, Khayter C, Foden J A, Thapar V, Reyon D, Goodwin M J, Aryee M J, Joung J K. Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nature Biotechnology, 2014, 32(6): 569–576

[34] Wang H, Yang H, Shivalila C S, Dawlaty M M, Cheng A W, Zhang F, Jaenisch R. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell, 2013, 153(4): 910–918

Acknowledgements

This study was supported by the Modern Agro-industry Technology Research Systems of China (CARAS-37) and the Domain Specific Projects for Transgenic Breeding (2014ZX08010004-008)

Supplementary materials The online version of this article at http://dx.doi.org/10.15302/J-FASE-2015059 contains supplementary material (Appendix A and B).

Compliance with ethics guidelines Mengxu Ge, Fei Liu, Fei Chang, Zhaolin Sun, Jing Fei, Ying Guo, Yunping Dai, Zhengquan Yu, Yaofeng Zhao, Ning Li and Qingyong Meng declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

All applicable institutional and national guidelines for the care and use of animals were followed.

RIGHTS & PERMISSIONS

Higher Education Press and Springer-Verlag Berlin Heidelberg