Tissue clearing and its applications in human tissues: A review

Abstract

In three-dimensional (3D) space, an unbiased and systemic view of human specimens between structures and functions is required. However, conventional histological sections from specimens have made only limited progress in exploring intact information about 3D biological tissues. With significant advances in optical physics and chemical engineering, state-of-the-art tissue-clearing methods can revolutionize the intact subcellular level of human tissue histological analysis, from thick human tissues to intact human organs. The present review summarizes the principle of tissue clearing so that a trainee researcher can implement effective human tissue-clearing protocols. Furthermore, this review highlights existing tissue-clearing methods in specific human tissue applications, describes imaging strategies, and presents various efficient computational approaches for processing and visualizing large image data. Finally, potential future directions for developing tissue-clearing methods for human tissues are also discussed.

Keywords

3D imaging / human tissue / light-sheet microscopy / tissue clearing

References

[1] a) S. Reardon, Nature 2016, 537, 597;b) H. B. Schiller, D. T. Montoro, L. M. Simon, E. L. Rawlins, K. B. Meyer, M. Strunz, F. A. Vieira Braga, W. Timens, G. H. Koppelman, G. R. S. Budinger, J. K. Burgess, A. Waghray, M. van den Berge, F. J. Theis, A. Regev, N. Kaminski, J. Rajagopal, S. A. Teichmann, A. V. Misharin, M. C. Nawijn, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2019, 61, 31.

[2] O. Rozenblatt-Rosen, J. W. Shin, J. E. Rood, A. Hupalowska, Human Cell Atlas Standards and Technology Working Group, A. Regev, H. Heyn, Nat. Biotechnol. 2021, 39, 149.

[3] J. T. C Liu, A. K. Glaser, K. Bera, L. D. True, N. P. Reder, K. W. Eliceiri, A. Madabhushi, Nat. Biomed. Eng. 2021, 5, 203.

[4] C. L. Walsh, P. Tafforeau, W. L. Wagner, D. J. Jafree, A. Bellier, C. Werlein, M. P. Kuhnel, E. Boller, S. Walker-Samuel, J. L. Robertus, D. A. Long, J. Jacob, S. Marussi, E. Brown, N. Holroyd, D. D. Jonigk, M. Ackermann, P. D. Lee, Nat. Methods 2021, 18, 1532.

[5] D. S. Tuch, V. J. Wedeen, A.M. Dale, J. S. George, J.W. Belliveau, Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 2001, 98, 11697.

[6] a) G. Schmidt, D. Dinter, M. F. Reiser, S. O. Schoenberg, Dtsch. Arztebl. Int. 2010, 107, 383; b) H. Fu, X. Wang, K. Diao, S. Huang, H. Liu, Y. Gao, Q. Zhao, Z. G. Yang, Y. K. Guo, Eur. Radiol. 2020, 30, 4705.

[7] T. Tian, Z. Yang, X. Li, J. Anat. 2021, 238, 489.

[8] W. Spalteholz, Uber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Praparaten: Nebst Anhang, Uber Knochenfarbung, Verlag von S. Hirzel, Leipzig 1911.

[9] I. Costantini, R. Cicchi, L. Silvestri, F. Vanzi, F. S. Pavone, Biomed. Opt. Express 2019, 10, 5251.

[10] P. Ariel, Int. J. Biochem. Cell Biol. 2017, 84, 35.

[11] J. Seo, M. Choe, S. Y. Kim, Mol. Cells 2019, 42, 96.

[12] H. R. Ueda, A. Erturk, K. Chung, V. Gradinaru, A. Chedotal, P. Tomancak, P. J. Keller, Nat. Rev. Neurosci. 2020, 21, 61.

[13] J. Huang, C. Brenna, A. U. M. Khan, C. Daniele, R. Rudolf, V. Heuveline, N. Gretz, Sci. Rep. 2019, 9, 521.

[14] W. Masselink, D. Reumann, P. Murawala, P. Pasierbek, Y. Taniguchi, F. Bonnay, K. Meixner, J. A. Knoblich, E.M. Tanaka, Development 2019, 146, dev166884.

[15] D. Jing, S. Zhang, W. Luo, X. Gao, Y. Men, C. Ma, X. Liu, Y. Yi, A. Bugde, B. O. Zhou, Z. Zhao, Q. Yuan, J. Q. Feng, L. Gao, W. P. Ge, H. Zhao, Cell Res. 2018, 28, 803.

[16] A. Erturk, K. Becker, N. Jahrling, C. P. Mauch, C. D. Hojer, J. G. Egen, F. Hellal, F. Bradke, M. Sheng, H. U. Dodt, Nat. Protoc. 2012, 7, 1983.

[17] C. Pan, R. Cai, F. P. Quacquarelli, A. Ghasemigharagoz, A. Lourbopoulos, P. Matryba, N. Plesnila, M. Dichgans, F. Hellal, A. Erturk, Nat. Methods 2016, 13, 859.

[18] Y. Li, J. Xu, P. Wan, T. Yu, D. Zhu, Front. Neuroanat. 2018, 12, 67.

[19] Y. Qi, T. Yu, J. Xu, P. Wan, Y. Ma, J. Zhu, Y. Li, H. Gong, Q. Luo, D. Zhu, Sci. Adv. 2019, 5, eaau8355.

[20] S. Abadie, C. Jardet, J. Colombelli, B. Chaput, A. David, J. L. Grolleau, P. Bedos, V. Lobjois, P. Descargues, J. Rouquette, Skin Res. Technol. 2018, 24, 294.

[21] P. Matryba, K. Lukasiewicz, M. Pawlowska, J. Tomczuk, J. Golab, Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 6730.

[22] N. Renier, Z. Wu, D. J. Simon, J. Yang, P. Ariel, M. Tessier-Lavigne, Cell 2014, 159, 896.

[23] R. Cai, C. Pan, A. Ghasemigharagoz, M. I. Todorov, B. Forstera, S. Zhao, H. S. Bhatia, A. Parra-Damas, L. Mrowka, D. Theodorou, M. Rempfler, A. L. R. Xavier, B. T. Kress, C. Benakis, H. Steinke, S. Liebscher, I. Bechmann, A. Liesz, B. Menze, M. Kerschensteiner, M. Nedergaard, A. Erturk, Nat.Neurosci. 2019, 22, 317.

[24] S. Zhao, M. I. Todorov, R. Cai, R. A. Maskari, H. Steinke, E. Kemter, H. Mai, Z. Rong, M. Warmer, K. Stanic, O. Schoppe, J. C. Paetzold, B. Gesierich, M. N. Wong, T. B. Huber, M. Duering, O. T. Bruns, B. Menze, J. Lipfert, V. G. Puelles, E. Wolf, I. Bechmann, A. Erturk, Cell 2020, 180, 796.

[25] M. Orlich, F. Kiefer, Histol. Histopathol. 2018, 33, 181.

[26] K. Matsumoto, T. T. Mitani, S. A. Horiguchi, J. Kaneshiro, T. C. Murakami, T. Mano, H. Fujishima, A. Konno, T. M. Watanabe, H. Hirai, H. R. Ueda, Nat. Protoc. 2019, 14, 3506.

[27] H. A. Messal, J. Almagro, M. Zaw Thin, A. Tedeschi, A. Ciccarelli, L. Blackie, K. I. Anderson, I. Miguel-Aliaga, J. van Rheenen, A. Behrens, Nat. Protoc. 2021, 16, 239.

[28] M. T. Ke, S. Fujimoto, T. Imai, Nat. Neurosci. 2013, 16, 1154.

[29] B. Hou, D. Zhang, S. Zhao, M. Wei, Z. Yang, S. Wang, J. Wang, X. Zhang, B. Liu, L. Fan, Y. Li, Z. Qiu, C. Zhang, T. Jiang, Front. Neuroanat. 2015, 9, 19.

[30] M. T. Ke, Y. Nakai, S. Fujimoto, R. Takayama, S. Yoshida, T. S. Kitajima, M. Sato, T. Imai, Cell Rep. 2016, 14, 2718.

[31] H. Hama, H. Hioki, K. Namiki, T. Hoshida, H. Kurokawa, F. Ishidate, T. Kaneko, T. Akagi, T. Saito, T. Saido, A. Miyawaki, Nat. Neurosci. 2015, 18, 1518.

[32] T. Kuwajima, A. A. Sitko, P. Bhansali, C. Jurgens, W. Guido, C. Mason, Development 2013, 140, 1364.

[33] E. A. Susaki, K. Tainaka, D. Perrin, F. Kishino, T. Tawara, T. M. Watanabe, C. Yokoyama, H. Onoe, M. Eguchi, S. Yamaguchi, T. Abe, H. Kiyonari, Y. Shimizu, A. Miyawaki, H. Yokota, H. R. Ueda, Cell 2014, 157, 726.

[34] E. A. Susaki, K. Tainaka, D. Perrin, H. Yukinaga, A. Kuno, H. R. Ueda, Nat. Protoc. 2015, 10, 1709.

[35] K. Tainaka, T. C. Murakami, E. A. Susaki, C. Shimizu, R. Saito, K. Takahashi, A. Hayashi-Takagi, H. Sekiya, Y. Arima, S. Nojima, M. Ikemura, T. Ushiku, Y. Shimizu, M. Murakami, K. F. Tanaka, M. Iino, H. Kasai, T. Sasaoka, K. Kobayashi, K. Miyazono, E. Morii, T. Isa, M. Fukayama, A. Kakita, H. R. Ueda, Cell Rep. 2018, 24, 2196.

[36] L. Liu, X. Xia, F. Xiang, Y. Gao, X. Li, H. Li, W. Zheng, Biomed. Opt. Express 2022, 13, 237.

[37] S. W. Choi, W. Guan, K. Chung, Cell 2021, 184, 4115.

[38] K. Chung, J. Wallace, S. Y. Kim, S. Kalyanasundaram, A. S. Andalman, T. J. Davidson, J. J. Mirzabekov, K. A. Zalocusky, J. Mattis, A. K. Denisin, S. Pak, H. Bernstein, C. Ramakrishnan, L. Grosenick, V. Gradinaru, K. Deisseroth, Nature 2013, 497, 332.

[39] P. H. Neckel, U. Mattheus, B. Hirt, L. Just, A. F. Mack, Sci. Rep. 2016, 6, 34331.

[40] T. Yu, J. Zhu, D. Li, D. Zhu, iScience 2021, 24, 102178.

[41] A. Greenbaum, K. Y. Chan, T. Dobreva, D. Brown, D. H. Balani, R. Boyce, H. M. Kronenberg, H. J. McBride, V. Gradinaru, Sci. Transl. Med. 2017, 9, eaah6518.

[42] E. Murray, J. H. Cho, D. Goodwin, T. Ku, J. Swaney, S. Y. Kim, H. Choi, Y. G. Park, J. Y. Park, A. Hubbert, M. McCue, S. Vassallo, N. Bakh, M. P. Frosch, V. J. Wedeen, H. S. Seung, K. Chung, Cell 2015, 163, 1500.

[43] Y. G. Park, C. H. Sohn, R. Chen, M. McCue, D. H. Yun, G. T. Drummond, T. Ku, N. B. Evans, H. C. Oak, W. Trieu, H. Choi, X. Jin, V. Lilascharoen, J. Wang, M. C. Truttmann, H. W. Qi, H. L. Ploegh, T. R. Golub, S. C. Chen, M. P. Frosch, H. J. Kulik, B. K. Lim, K. Chung, Nat. Biotechnol. 2019, 37, 73.

[44] E. Lee, J. Choi, Y. Jo, J. Y. Kim, Y. J. Jang, H. M. Lee, S. Y. Kim, H. J. Lee, K. Cho, N. Jung, E. M. Hur, S. J. Jeong, C. Moon, Y. Choe, I. J. Rhyu, H. Kim, W. Sun, Sci. Rep. 2016, 6, 18631.

[45] H. Du, P. Hou, L. Wang, Z. Wang, Q. Li, Sci. Rep. 2019, 9, 10571.

[46] J. Choi, E. Lee, J. H. Kim, W. Sun, Exp. Neurobiol. 2019, 28, 436.

[47] M. P. I Williams, M. Rigon, T. Straka, S. J. Horner, M. Thiel, N. Gretz, M. Hafner, M. Reischl, R. Rudolf, Front. Cell. Neurosci. 2019, 13, 49.

[48] W. Li, R. N. Germain, M. Y. Gerner, Nat. Protoc. 2019, 14, 1708.

[49] A. J. Moy, B. V. Capulong, R. B. Saager, M. P. Wiersma, P. C. Lo, A. J. Durkin, B. Choi, J. Biomed. Opt. 2015, 20, 95010.

[50] S. P. Amato, F. Pan, J. Schwartz, T. M. Ragan, Front. Neuroanat. 2016, 10, 31.

[51] Z. Wang, J. Zhang, G. Fan, H. Zhao, X. Wang, J. Zhang, P. Zhang, W. Wang, Biomed. Opt. Express 2018, 9, 423.

[52] B. Hohberger, C. Baumgart, A. Bergua, Eye 2017, 31, 1496.

[53] E. Fernandez, S. Marull-Tufeu, Skin Res. Technol. 2019, 25, 735.

[54] M. Litvinukova, C. Talavera-Lopez, H. Maatz, D. Reichart, C. L. Worth, E. L. Lindberg, M. Kanda, K. Polanski, M. Heinig, M. Lee, E. R. Nadelmann, K. Roberts, L. Tuck, E. S. Fasouli, D. M. DeLaughter, B. McDonough, H. Wakimoto, J. M. Gorham, S. Samari, K. T. Mahbubani, K. Saeb-Parsy, G. Patone, J. J. Boyle, H. Zhang, H. Zhang, A. Viveiros, G. Y. Oudit, O. A. Bayraktar, J. G. Seidman, C. E. Seidman, M. Noseda, N. Hubner, S. A. Teichmann, Nature 2020, 588, 466.

[55] E. A. Zerhouni, D. M. Parish, W. J. Rogers, A. Yang, E. P. Shapiro, Radiology 1988, 169, 59.

[56] H. Kolesova, V. Olejnickova, A. Kvasilova, M. Gregorovicova, D. Sedmera, iScience 2021, 24, 102387.

[57] F. Perbellini, A. K. L. Liu, S. A. Watson, I. Bardi, S. M. Rothery, C. M. Terracciano, Sci. Rep. 2017, 7, 5188.

[58] J. Dolensek, M. S. Rupnik, A. Stozer, Islets 2015, 7, e1024405.

[59] J. L. Fowler, S. S. Lee, Z. C. Wesner, S. K. Olehnik, S. J. Kron, M. Hara, Endocrinology 2018, 159, 1393.

[60] E. Butterworth, W. Dickerson, V. Vijay, K. Weitzel, J. Cooper, E. W. Atkinson, J. E. Coleman, K. J. Otto, M. Campbell-Thompson, J. Vis. Exp. 2018, 131, 56859.

[61] M. Noe, N. Rezaee, K. Asrani, M. Skaro, V. P. Groot, P. H. Wu, M. T. Olson, S. M. Hong, S. J. Kim, M. J. Weiss, C. L. Wolfgang, M. A. Makary, J. He, J. L. Cameron, D. Wirtz, N. J. Roberts, G. J. A. Offerhaus, L. A. A. Brosens, L. D. Wood, R. H. Hruban, Am. J. Pathol. 2018, 188, 1530.

[62] S. C. Tang, L. Baeyens, C. N. Shen, S. J. Peng, H. J. Chien, D. W. Scheel, C. E. Chamberlain, M. S. German, Diabetologia 2018, 61, 168.

[63] V. G. Puelles, A. N. Combes, J. F. Bertram, Kidney Int. 2021, 100, 780.

[64] D. Isaacson, J. Shen, D. McCreedy, M. Calvert, T. McDevitt, G. Cunha, L. Baskin, Kidney Int. 2018, 93, 525.

[65] D. Isaacson, J. Shen, M. Overland, Y. Li, A. Sinclair, M. Cao, D. McCreedy, M. Calvert, T. McDevitt, G. R. Cunha, L. Baskin, Differentiation 2018, 103, 14.

[66] a) A. Parra-Damas, C. A. Saura, Front. Neurosci. 2020, 14, 914; b) R. Fang, C. Xia, J. L. Close, M. Zhang, J. He, Z. Huang, A. R. Halpern, B. Long, J. A. Miller, E. S. Lein, X. Zhuang, Science 2022, 377, 56.c) M. Scardigli, L. Pesce, N. Brady, G. Mazzamuto, V. Gavryusev, L. Silvestri, P. R. Hof, C. Destrieux, I. Costantini, F. S. Pavone, Front.Neuroanat. 2021, 15, 752234.

[67] F. Casoni, S. A. Malone, M. Belle, F. Luzzati, F. Collier, C. Allet, E. Hrabovszky, S. Rasika, V. Prevot, A. Chedotal, P. Giacobini, Development 2016, 143, 3969.

[68] A. K. Liu, M. E. Hurry, O. T. Ng, J. DeFelice, H. M. Lai, R. K. Pearce, G. T. Wong, R. C. Chang, S.M. Gentleman, Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2016, 42, 573.

[69] S. Hildebrand, A. Schueth, A. Herrler, R. Galuske, A. Roebroeck, Sci. Rep. 2019, 9, 10880.

[70] M. Inoue, R. Saito, A. Kakita, K. Tainaka, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2019, 29, 1886.

[71] A. K. L Liu, H. M. Lai, R. C. Chang, S. M. Gentleman, Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2017, 43, 346.

[72] H. M. Lai, A. K. L. Liu, H. H. M. Ng, M. H. Goldfinger, T. W. Chau, J. DeFelice, B. S. Tilley, W. M. Wong, W. Wu, S. M. Gentleman, Nat. Commun. 2018, 9, 1066.

[73] K. Ando, Q. Laborde, A. Lazar, D. Godefroy, I. Youssef, M. Amar, A. Pooler, M. C. Potier, B. Delatour, C. Duyckaerts, Acta Neuropathol. 2014, 128, 457.

[74] a) S. Kostrikov, K. B. Johnsen, T. H. Braunstein, J. M. Gudbergsson, F. P. Fliedner, E. A. A. Obara, P. Hamerlik, A. E. Hansen, A. Kjaer, C. Hempel, T. L. Andresen, Commun. Biol. 2021, 4, 815; b) C. H. Harrison, G. R. Buckland, S. E. Brooks, D. A. Johnston, D. S. Chatelet, A. K. L. Liu, S. M. Gentleman, D. Boche, J. A. R. Nicoll, J. Anat. 2018, 232, 1025.

[75] L. Decroix, V. Van Muylder, L. Desender, M. Sampaolesi, L. Thorrez, Biotech. Histochem. 2015, 90, 424.

[76] W. Denk, J. H. Strickler, W.W. Webb, Science 1990, 248, 73.

[77] T. Ragan, L. R. Kadiri, K. U. Venkataraju, K. Bahlmann, J. Sutin, J. Taranda, I. Arganda-Carreras, Y. Kim, H. S. Seung, P. Osten, Nat. Methods 2012, 9, 255.

[78] a) E. G. Reynaud, U. Krzic, K. Greger, E. H. Stelzer, HFSP J. 2008, 2, 266;b) R. M. Power, J. Huisken, Nat. Methods 2017, 14, 360.

[79] P. A. Santi, J. Histochem. Cytochem. 2011, 59, 129.

[80] R. Tomer, K. Khairy, P. J. Keller, Curr. Opin. Genet. Dev. 2011, 21, 558.

[81] P. J. Verveer, J. Swoger, F. Pampaloni, K. Greger, M. Marcello, E. H. Stelzer, Nat. Methods 2007, 4, 311.

[82] B. C. Chen, W. R. Legant, K. Wang, L. Shao, D. E. Milkie, M. W. Davidson, C. Janetopoulos, X. S. Wu, J. A. Hammer, 3rd, Z. Liu, B. P. English, Y. Mimori-Kiyosue, D. P. Romero, A. T. Ritter, J. Lippincott-Schwartz, L. Fritz-Laylin, R. D. Mullins, D. M. Mitchell, J. N. Bembenek, A. C. Reymann, R. Bohme, S. W. Grill, J. T. Wang, G. Seydoux, U. S. Tulu, D. P. Kiehart, E. Betzig, Science 2014, 346, 1257998.

[83] a) U. Krzic, S. Gunther, T. E. Saunders, S. J. Streichan, L. Hufnagel, Nat. Methods 2012, 9, 730;b) R. Tomer, K. Khairy, F. Amat, P. J. Keller, Nat. Methods 2012, 9, 755.

[84] a) J. Huisken, D. Y. Stainier, Development 2009, 136, 1963;b) M. Aakhte, H. J. Muller, Development 2021, 148, dev199725.

[85] A. Kumar, Y. Wu, R. Christensen, P. Chandris, W. Gandler, E. McCreedy, A. Bokinsky, D. A Colon-Ramos, Z. Bao, M. McAuliffe, G. Rondeau, H. Shroff, Nat. Protoc. 2014, 9, 2555.

[86] R. K. Chhetri, F. Amat, Y. Wan, B. Hockendorf, W. C. Lemon, P. J. Keller, Nat. Methods 2015, 12, 1171.

[87] A. H. Voie, D. H. Burns, F. A. Spelman, J. Microsc. 1993, 170, 229.

[88] F. Amat, B. Hockendorf, Y. Wan, W. C. Lemon, K. McDole, P. J. Keller, Nat. Protoc. 2015, 10, 1679.

[89] J. Ellenberg, J. R. Swedlow, M. Barlow, C. E. Cook, U. Sarkans, A. Patwardhan, A. Brazma, E. Birney, Nat. Methods 2018, 15, 849.

[90] D. Atan, C. Foy, P. H. Scanlon, Eye 2008, 22, 471.

[91] H. C. Gibbs, S. M. Mota, N. A. Hart, S. W. Min, A. O. Vernino, A. L. Pritchard, A. Sen, S. Vitha, S. Sarasamma, A. L. McIntosh, A. T. Yeh, A. C. Lekven, D. A. McCreedy, K. C. Maitland, L. M. Perez, Front. Cell Dev. Biol. 2021, 9, 739079.

[92] J. Schindelin, I. Arganda-Carreras, E. Frise, V. Kaynig, M. Longair, T. Pietzsch, S. Preibisch, C. Rueden, S. Saalfeld, B. Schmid, J. Y. Tinevez, D. J. White, V. Hartenstein, K. Eliceiri, P. Tomancak, A. Cardona, Nat. Methods 2012, 9, 676.

[93] L. A. Royer, M. Weigert, U. Gunther, N. Maghelli, F. Jug, I. F. Sbalzarini, E.W. Myers, Nat. Methods 2015, 12, 480.

[94] A. Bria, G. Iannello, L. Onofri, H. Peng, Nat. Methods 2016, 13, 192.

[95] H. Peng, Z. Ruan, F. Long, J. H. Simpson, E. W. Myers, Nat. Biotechnol. 2010, 28, 348.

[96] T. Pietzsch, S. Saalfeld, S. Preibisch, P. Tomancak, Nat. Methods 2015, 12, 481.

[97] E. F. Pettersen, T. D. Goddard, C. C. Huang, G. S. Couch, D. M. Greenblatt, E. C. Meng, T. E. Ferrin, J. Comput. Chem. 2004, 25, 1605.

[98] D. S. Kermany, M. Goldbaum, W. Cai, C. C. S. Valentim, H. Liang, S. L. Baxter, A. McKeown, G. Yang, X. Wu, F. Yan, J. Dong, M. K. Prasadha, J. Pei, M. Y. L. Ting, J. Zhu, C. Li, S. Hewett, J. Dong, I. Ziyar, A. Shi, R. Zhang, L. Zheng, R. Hou, W. Shi, X. Fu, Y. Duan, V. A. N. Huu, C. Wen, E. D. Zhang, C. L. Zhang, O. Li, X. Wang, M. A. Singer, X. Sun, J. Xu, A. Tafreshi, M. A. Lewis, H. Xia, K. Zhang, Cell 2018, 172, 1122.

[99] C. Prahst, P. Ashrafzadeh, T. Mead, A. Figueiredo, K. Chang, D. Richardson, L. Venkaraman, M. Richards, A. M. Russo, K. Harrington, M. Ouarne, A. Pena, D. F. Chen, L. Claesson-Welsh, K. S. Cho, C. A. Franco, K. Bentley, Elife 2020, 9, e49779.

RIGHTS & PERMISSIONS

2024 The Authors. View published by Shanghai Fuji Technology Consulting Co., Ltd, authorized by Professional Community of Experimental Medicine, National Association of Health Industry and Enterprise Management (PCEM) and John Wiley & Sons Australia, Ltd.