Prediction of C-glycosylated apigenin (vitexin) biosynthesis in Ficus deltoidea based on plant proteins identified by LC-MS/MS

Abstract

BACKGROUND: Plant secondary metabolites act as defence molecules to protect plants from biotic and abiotic stresses. In particular, C-glycosylated flavonoids are more stable and reactive than their O-glycosylated counterparts. Therefore, vitexin (apigenin 8-C glucoside) present in Ficus deltoidea is well-known for its antioxidant, anti-inflammatory, and antidiabetic properties.

METHODS: Phenol based extraction was used to extract proteins (0.05% yield) with less plant pigments. This can be seen from clear protein bands in gel electrophoresis. In-gel trypsin digestion was subsequently carried out and analysed for the presence of peptides by LC-MS/MS.

RESULTS: Thirteen intact proteins are identified on a 12% polyacrylamide gel. The mass spectra matching was found to have 229 proteins, and 11.4% of these were involved in secondary metabolism. Proteins closely related to vitexin biosynthesis are listed and their functions are explained mechanistically. Vitexin synthesis is predicted to involve plant polyketide chalcone synthase, isomerization by chalcone isomerase, oxidation by cytochrome P450 to convert flavanone to flavone, and transfer of sugar moiety by C-glycosyltransferase, followed by dehydration to produce flavone-8-C-glucosides.

CONCLUSIONS: Phenol based extraction, followed by gel electrophoresis and LC-MS/MS could identify proteome explaining vitexin biosynthesis in F. deltoidea. Many transferases including β-1,3-galactosyltransferase 2 and glycosyl hydrolase family 10 protein were detected in this study. This explains the importance of transferase family proteins in C-glycosylated apigenin biosynthesis in medicinal plant.

Key words： C-glycosylation; vitexin; apigenin 8-C glucoside; proteins; peptides; LC-MS/MS

Acknowledgements

The authors would like to thank theMinistry of Higher Education for their financial support under theHiCoE grant (4J263) to carry out this project.

Compliance with ethics guidelines

Farah Izana Abdullah, Lee Suan Chua,and Zaidah Rahmat declare that they have no conflicts of interest.

References

1 Adam Z, Khamis  S, Ismail A ,  Hamid M  (2012). Ficus deltoidea: A potential alternative medicine fordiabetes mellitus. Evid Based ComplementAlternat Med, 2012: 632763

PMID

2 Afrin S, Huang  J J, Luo  Z Y (2015). JA-mediated transcriptionalregulation of secondary metabolism in medicinal plants. Sci Bull, 60(12): 1062–1072

3 Akashi T, Aoki  T, Ayabe S  (2005). Molecular and biochemical characterization of 2-hydroxyisoflavanone dehydratase. Involvementof carboxylesterase-like proteins in leguminous isoflavone biosynthesis. Plant Physiol, 137(3): 882–891

PMID

4 Akashi T, Fukuchi-Mizutani  M, Aoki T ,  Ueyama Y ,  Yonekura-Sakakibara K ,  Tanaka Y ,  Kusumi T ,  Ayabe S  (1999). Molecular cloning and biochemical characterization of a novel cytochromeP450, flavone synthase II, that catalyzes direct conversion of flavanonesto flavones. Plant Cell Physiol, 40(11): 1182–1186

PMID

5 Akey D L, Razelun  J R, Tehranisa  J, Sherman D H ,  Gerwick W H ,  Smith J L  (2010). Crystal structures of dehydratase domains from the curacin polyketide biosyntheticpathway. Structure, 18(1): 94–105

PMID

6 Alejandro S, Lee  Y, Tohge T ,  Sudre D ,  Osorio S ,  Park J, Bovet  L, Lee Y ,  Geldner N ,  Fernie A R ,  Martinoia E  (2012). AtABCG29 is a monolignol transporter involved in lignin biosynthesis. Curr Biol, 22(13): 1207–1212

PMID

7 Austin M B, Noel  J P (2003). The chalcone synthase superfamily of type III polyketide synthases. Nat Prod Rep, 20(1): 79–110

PMID

8 Azemin A, Dharmaraj  S, Hamdan M R ,  Mat N, Ismail  Z, Khamsah S M  (2014). Discriminating Ficus deltoidea var. bornensis from Different Localities by HPTLC and FTIR Fingerprinting. J Appl Pharm Sci, 4: 69–75

9 Bak S, Beisson  F, Bishop G ,  Hamberger B ,  Höfer R ,  Paquette S  (2011). Cytochromes P450. Arab B, e0144 

10 Bednar R A, Hadcock  J R (1988). Purification and characterization of chalcone isomerasefrom soybeans. J Biol Chem, 263(20): 9582–9588

PMID

11 Bernhoft A, Siem  H, Bjertness E ,  Meltzer M ,  Flaten T ,  Holmsen E  (2010). Bioactive compounds in plants–benefits and risks for man and animals. in Proceedings from a Symposium Held at The Norwegian Academy of Science and Letters,Novus forlag, Oslo

12 Bradford M M (1976). A rapid and sensitive method forthe quantitation of microgram quantities of protein utilizing theprinciple of protein-dye binding. Anal Biochem, 72(1-2): 248–254

PMID

13 Brazier-Hicks M, Edwards  R (2013). Metabolic engineering of the flavone-C-glycoside pathwayusing polyprotein technology. Metab Eng, 16: 11–20

PMID

14 Brazier-Hicks M, Evans  K M, Cunningham  O D, Hodgson  D R W, Steel  P G, Edwards  R (2008). Catabolism of glutathioneconjugates in Arabidopsis thaliana. Role in metabolic reactivation of the herbicide safener fenclorim. J Biol Chem, 283(30): 21102–21112

PMID

15 Brazier-Hicks M, Evans  K M, Gershater  M C, Puschmann  H, Steel P G ,  Edwards R  (2009). The C-glycosylation of flavonoids in cereals. J Biol Chem, 284(27): 17926–17934

PMID

16 Bungaruang L, Gutmann  A, Nidetzky B  (2013). Leloir glycosyltransferases and natural product glycosylation: Biocatalyticsynthesis of the C-glucoside nothofagin, a major antioxidant of redbushherbal tea. Adv Synth Catal, 355(14-15): 2757–2763

PMID

17 Cheng H, Li  L, Cheng S ,  Cao F, Wang  Y, Yuan H  (2011). Molecular cloning and function assay of a chalcone isomerase gene (GbCHI) from Ginkgo biloba. Plant Cell Rep, 30(1): 49–62

PMID

18 Choo C Y, Sulong  N Y, Man  F, Wong T W  (2012). Vitexin and isovitexin from the Leaves of Ficus deltoidea with in-vivo α-glucosidase inhibition. J Ethnopharmacol, 142(3): 776–781

PMID

19 Courts F L, Williamson  G (2015). Critical Reviews in Food Science and Nutrition The occurrence,fate and biological activities of C- glycosyl flavonoids in the humandiet. Crit Rev Food Sci Nutr, 55(10): 1352–1367

PMID

20 Crosby K C, Pietraszewska-Bogiel  A, Gadella T W J  Jr,  Winkel B S J  (2011). Förster resonance energy transfer demonstrates a flavonoid metabolon in livingplant cells that displays competitive interactions between enzymes. FEBS Lett, 585(14): 2193–2198

PMID

21 Crozier A, Jaganath  I B, Clifford  M N (2009). Dietary phenolics: chemistry, bioavailability and effects on health. Nat Prod Rep, 26(8): 1001–1043

PMID

22 Day A J, Gee  J M, DuPont  M S, Johnson  I T, Williamson  G (2003). Absorption of quercetin-3-glucoside and quercetin-4′-glucoside in the ratsmall intestine: the role of lactase phlorizin hydrolase and the sodium-dependentglucose transporter. Biochem Pharmacol, 65(7): 1199–1206 

PMID

23 Dey S, Corina Vlot  A (2015). Ethylene responsive factors in the orchestration ofstress responses in monocotyledonous plants. Front Plant Sci, 6: 640

PMID

24 Dixon D P, Hawkins  T, Hussey P J ,  Edwards R  (2009). Enzyme activities and subcellular localization of members of the Arabidopsis glutathione transferasesuperfamily. J Exp Bot, 60(4): 1207–1218

PMID

25 Du Y, Chu  H, Chu I K ,  Lo C (2010a). CYP93G2 is a flavanone 2-hydroxylase required for C-glycosyl-flavonebiosynthesis in rice. Plant Physiol, 154(1):324–33

26 Du Y, Chu  H, Wang M ,  Chu I K ,  Lo C (2010b). Identificationof flavone phytoalexins and a pathogen-inducible flavone synthaseII gene (SbFNSII) in sorghum. J Exp Bot, 61(4): 983–994

PMID

27 Dürr C, Hoffmeister  D, Wohlert S E ,  Ichinose K ,  Weber M ,  Von Mulert U ,  Thorson J S ,  Bechthold A  (2004). The glycosyltransferase UrdGT2 catalyzes both C- andO-glycosidic sugar transfers. Angew Chem Int Ed Engl, 43(22): 2962–2965

PMID

28 Dzolin S, Ahmad  R, Zain M M ,  Ismail M I  (2015). Flavonoid distribution in four varieties of Ficus deltoidea (Jack). J Med Plant Herb Ther Res, 3: 1–9

29 El Amrani A, Barakate  A, Askari B M ,  Li X, Roberts  A G, Ryan  M D, Halpin  C (2004). Coordinate expression and independentsubcellular targeting of multiple proteins from a single transgene. Plant Physiol, 135(1): 16–24

PMID

30 Falcone Ferreyra M L ,  Rodriguez E ,  Casas M I ,  Labadie G ,  Grotewold E ,  Casati P  (2013). Identification of a bifunctional maize C- and O-glucosyltransferase. J Biol Chem, 288(44): 31678–31688

PMID

31 Farsi E, Shafaei  A, Hor S Y ,  Ahamed M B K ,  Fei M, Attitalla  I H (2011). Correlation between enzymes inhibitory effects and antioxidant activities of standardizedfractions of methanolic extract obtained from Ficus deltoidea leaves. Afr J Biotechnol, 10(67): 15184–15194

32 François I E J A ,  Van Hemelrijck W ,  Aerts A M ,  Wouters P F J ,  Proost P ,  Broekaert W F ,  Cammue B P A  (2004). Processing in Arabidopsis thaliana of a heterologous polyprotein resulting indifferential targeting of the individual plant defensins. Plant Sci, 166(1): 113–121

33 Ha S H, Liang  Y S, Jung  H, Ahn M J ,  Suh S C ,  Kweon S J ,  Kim D H ,  Kim Y M ,  Kim J K  (2010). Application of two bicistronic systems involving 2Aand IRES sequences to the biosynthesis of carotenoids in rice endosperm. Plant Biotechnol J, 8(8): 928–938

PMID

34 Hakamatsuka T, Mori  K, Ishida S ,  Ebizuka Y ,  Sankawa U  (1998). Purification of 2-hydroxyisoflavanone dehydratase from the Cell Cultures of Pueraria lobata. Phytochemistry, 49(2): 497–505

35 Halpin C, Cooke  S E, Barakate  A, El Amrani A ,  Ryan M D  (1999). Self-processing 2A-polyproteins--a system for co-ordinate expression of multiple proteinsin transgenic plants. Plant J, 17(4): 453–459

PMID

36 Hasegawa K, Cowan  A B, Nakatsuji  N, Suemori H  (2007). Efficient multicistronic expression of a transgene inhuman embryonic stem cells. Stem Cells, 25(7): 1707–1712

PMID

37 He M, Min  J W, Kong  W L, He  X H, Li  J X, Peng  B W (2016). A review on the pharmacological effectsof vitexin and isovitexin. Fitoterapia, 115: 74–85

PMID

38 Hicks M A, Barber  A E 2nd, Giddings  L A, Caldwell  J, O’Connor S E ,  Babbitt P C  (2011). The evolution of function in strictosidine synthase-like proteins. Proteins, 79(11): 3082–3098

PMID

39 Isaacson T, Damasceno  C M B, Saravanan  R S, He  Y, Catalá C ,  Saladié M ,  Rose J K  (2006). Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc, 1(2): 769–774

PMID

40 Ishihara A, Ogura  Y, Tebayashi S ,  Iwamura H  (2002). Jasmonate-induced changes in flavonoid metabolism inbarley (Hordeum vulgare) leaves. Biosci Biotechnol Biochem, 66(10): 2176–2182

PMID

41 Ishikawa F, Haushalter  R W, Burkart  M D (2012). Dehydratase-specific probes for fatty acid and polyketide synthases. J Am Chem Soc, 134(2): 769–772

PMID

42 Jiménez C R ,  Huang L ,  Qiu Y, Burlingame  A L (2001). Searching sequence databases overthe internet: protein identification using MS-Fit. Curr Protoc Protein Sci, Chapter 16: 5

PMID

43 Kaltenbach M, Schröder  G, Schmelzer E ,  Lutz V, Schröder  J (1999). Flavonoid hydroxylase from Catharanthus roseus: cDNA,heterologous expression, enzyme properties and cell-type specificexpression in plants. Plant J, 19(2): 183–193

PMID

44 Kašparová M ,  Siatka T  (2014). Production of flavonoids and isoflavonoids in jasmonic acid-induced red clover suspension cultures. Ceska Slov Farm, 63(1): 17–21

PMID

45 Kerscher F, Franz  G (1987). Biosynthesis of Vitexin and Isovitexin : Enzymatic Synthesis of theC-Glucosylflavones Vitexin and Isovitexin with an Enzyme Preparationfrom Fagopyrum esculentum M. Seedlings. Z Naturforsch C, 42: 519–524

46 Kramell R, Miersch  O, Atzorn R ,  Parthier B ,  Wasternack C  (2000). Octadecanoid-derived alteration of gene expression andthe “oxylipin signature” in stressed barley leaves. Implicationsfor different signaling pathways. Plant Physiol, 123(1): 177–188

PMID

47 Laemmli U K (1970). Cleavage of structural proteins duringthe assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259): 680–685

PMID

48 Le Roy J, Huss  B, Creach A ,  Hawkins S ,  Neutelings G  (2016). Glycosylation Is a Major Regulator of Phenylpropanoid Availability and BiologicalActivity in Plants. Front Plant Sci, 7: 735

PMID

49 Li Y, Dodge  G J, Fiers  W D, Fecik  R A, Smith  J L, Aldrich  C C (2015). Functional Characterization of aDehydratase Domain from the Pikromycin Polyketide Synthase. J Am Chem Soc, 137(22): 7003–7006

PMID

50 Luley-Goedl C, Nidetzky  B (2011). Glycosides as compatible solutes: biosynthesis and applications. Nat Prod Rep, 28(5): 875–896

PMID

51 Lussier F X, Colatriano  D, Wiltshire Z ,  Page J E ,  Martin V J J  (2013). Engineering microbes for plant polyketide biosynthesis. Comput Struct Biotechnol J, 3(4): e201210020

PMID

52 Martens S, Mithöfer  A (2005). Flavones and flavone synthases. Phytochemistry, 66(20): 2399–2407

PMID

53 Mierziak J, Kostyn  K, Kulma A  (2014). Flavonoids as important molecules of plant interactions with the environment. Molecules, 19(10): 16240–16265

PMID

54 Misbah H, Aziz  A A, Aminudin  N (2013). Antidiabetic and antioxidant properties of Ficus deltoidea fruit extracts and fractions. BMC Complement Altern Med, 13(1): 118

PMID

55 Mizutani M, Sato  F (2011). Unusual P450 reactions in plant secondary metabolism. Arch Biochem Biophys, 507(1): 194–203

PMID

56 Mohd K S, Rosli  A S, Azemin  A, Mat N ,  Zakaria A J  (2016). Comprehensive Biological Activities Evaluation and Quantification of Marker Compoundsof Ficus deltoiea Jack Varieties. Int J Pharmacogn Phytochem Res, 8: 1698–1708

57 Morant M, Bak  S, Møller B L ,  Werck-Reichhart D  (2003). Plant cytochromes P450: tools for pharmacology, plant protection and phytoremediation. Curr Opin Biotechnol, 14(2): 151–162

PMID

58 Nagatomo Y, Usui  S, Ito T ,  Kato A, Shimosaka  M, Taguchi G  (2014). Purification, molecular cloning and functional characterization of flavonoid C-glucosyltransferases from Fagopyrum esculentum M. (buckwheat) cotyledon. Plant J, 80(3): 437–448

PMID

59 Pauwels L, Inzé  D, Goossens A  (2009). Jasmonate-inducible gene: What does it mean? Trends Plant Sci, 14(2): 87–91

PMID

60 Praveena R, Sadasivam  K, Kumaresan R ,  Deepha V ,  Sivakumar R  (2013). Experimental and DFT studies on the antioxidant activityof a C-glycoside from Rhynchosia capitata. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 103: 442–452

PMID

61 Rawat P, Kumar  M, Sharan K ,  Chattopadhyay N ,  Maurya R  (2009). Ulmosides A and B: flavonoid 6-C-glycosides from Ulmus wallichiana, stimulatingosteoblast differentiation assessed by alkaline phosphatase. Bioorg Med Chem Lett, 19(16): 4684–4687

PMID

62 Saito K, Yonekura-Sakakibara  K, Nakabayashi R ,  Higashi Y ,  Yamazaki M ,  Tohge T ,  Fernie A R  (2013). The flavonoid biosynthetic pathway in Arabidopsis: structural and genetic diversity. Plant Physiol Biochem, 72: 21–34

PMID

63 Schaller F (2001). Enzymes of the biosynthesis of octadecanoid-derivedsignalling molecules. J Exp Bot, 52(354): 11–23

PMID

64 Shafaei A, Farsi  E, Ismail Z ,  Asmawi M Z  (2012). Quantitative High Performance Thin-Layer ChromatographyMethod for Analysis of Vitexin and Isovitexin in Extracts of Leavesof Ficus deltoidea. Asian J Chem, 24: 2286

65 Shevchenko A, Tomas  H, Havlis J ,  Olsen J V ,  Mann M (2006). In-geldigestion for mass spectrometric characterization of proteins andproteomes. Nat Protoc, 1(6): 2856–2860

PMID

66 Stafford H A (1991). Flavonoid evolution: an enzymic approach. Plant Physiol, 96(3): 680–685

PMID

67 University of California (2017). Ms-Fit. Available at: http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msfitstandard.

68 Väisänen E E ,  Smeds A I ,  Fagerstedt K V ,  Teeri T H ,  Willför S M ,  Kärkönen A  (2015). Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotianabenthamiana seedlings. Planta, 242(3): 747–760

PMID

69 Wu J, Zaleski  T J, Valenzano  C, Khosla C ,  Cane D E  (2005). Polyketide double bond biosynthesis. Mechanistic analysis of thedehydratase-containing module 2 of the picromycin/methymycin polyketidesynthase. J Am Chem Soc, 127(49): 17393–17404

PMID

70 Xiao J, Capanoglu  E, Jassbi A R ,  Miron A  (2016). Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr, 56(sup1 Suppl 1): S29–S45

PMID

71 Xiao J, Chen  T, Cao H  (2015). Flavonoid glycosylation and biological benefits. Biotechnol Adv, 

PMID

72 Xu F, Li  L, Zhang W ,  Cheng H ,  Sun N, Cheng  S, Wang Y  (2012). Isolation, characterization, and function analysis of a flavonolsynthase gene from Ginkgo biloba. Mol Biol Rep, 39(3): 2285–2296

PMID

73 Yang C Q, Fang  X, Wu X M ,  Mao Y B ,  Wang L J ,  Chen X Y  (2012). Transcriptional regulation of plant secondary metabolism. J Integr Plant Biol, 54(10): 703–712

PMID

74 Yonekura-Sakakibara K ,  Hanada K  (2011). An evolutionary view of functional diversity in family1 glycosyltransferases. Plant J, 66(1): 182–193

PMID

75 Yonekura-Sakakibara K ,  Tohge T ,  Matsuda F ,  Nakabayashi R ,  Takayama H ,  Niida R ,  Watanabe-Takahashi A ,  Inoue E ,  Saito K  (2008). Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leadingto decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis. Plant Cell, 20(8): 2160–2176

PMID

76 Zhai R, Wang  Z, Zhang S ,  Meng G, Song  L, Wang Z ,  Li P, Ma  F, Xu L  (2016). Two MYB transcription factors regulate flavonoid biosynthesis inpear fruit (Pyrus bretschneideri Rehd.). J Exp Bot, 67(5): 1275–1284

PMID

77 Zhang X, Abrahan  C, Colquhoun T A ,  Liu C and Sciences A (2017). A proteolytic regulator controlling chalcone synthasestability and flavonoid biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell Online, tpc-00855

78 Zhao J, Davis  L C, Verpoorte  R (2005). Elicitor signal transductionleading to production of plant secondary metabolites. Biotechnol Adv, 23(4): 283–333

PMID

79 Zunoliza A, Khalid  H, Zhari I ,  Rasadah M A  (2009). Anti-inflammatory activity of standardised extractsof leaves of three varieties of Ficus deltoidea. Int J Pharm Clin Res, 1: 100–105