Prediction of C-glycosylated apigenin (vitexin) biosynthesis in Ficus deltoidea based on plant proteins identified by LC-MS/MS

Farah Izana Abdullah, Lee Suan Chua, Zaidah Rahmat

PDF(552 KB)
PDF(552 KB)
Front. Biol. ›› 2017, Vol. 12 ›› Issue (6) : 448-458. DOI: 10.1007/s11515-017-1472-0
RESEARCH ARTICLE
RESEARCH ARTICLE

Prediction of C-glycosylated apigenin (vitexin) biosynthesis in Ficus deltoidea based on plant proteins identified by LC-MS/MS

Author information +
History +

Abstract

BACKGROUND: Plant secondary metabolites act as defence molecules to protect plants from biotic and abiotic stresses. In particular, C-glycosylated flavonoids are more stable and reactive than their O-glycosylated counterparts. Therefore, vitexin (apigenin 8-C glucoside) present in Ficus deltoidea is well-known for its antioxidant, anti-inflammatory, and antidiabetic properties.

METHODS: Phenol based extraction was used to extract proteins (0.05% yield) with less plant pigments. This can be seen from clear protein bands in gel electrophoresis. In-gel trypsin digestion was subsequently carried out and analysed for the presence of peptides by LC-MS/MS.

RESULTS: Thirteen intact proteins are identified on a 12% polyacrylamide gel. The mass spectra matching was found to have 229 proteins, and 11.4% of these were involved in secondary metabolism. Proteins closely related to vitexin biosynthesis are listed and their functions are explained mechanistically. Vitexin synthesis is predicted to involve plant polyketide chalcone synthase, isomerization by chalcone isomerase, oxidation by cytochrome P450 to convert flavanone to flavone, and transfer of sugar moiety by C-glycosyltransferase, followed by dehydration to produce flavone-8-C-glucosides.

CONCLUSIONS: Phenol based extraction, followed by gel electrophoresis and LC-MS/MS could identify proteome explaining vitexin biosynthesis in F. deltoidea. Many transferases including β-1,3-galactosyltransferase 2 and glycosyl hydrolase family 10 protein were detected in this study. This explains the importance of transferase family proteins in C-glycosylated apigenin biosynthesis in medicinal plant.

Keywords

C-glycosylation / vitexin / apigenin 8-C glucoside / proteins / peptides / LC-MS/MS

Cite this article

Download citation ▾
Farah Izana Abdullah, Lee Suan Chua, Zaidah Rahmat. Prediction of C-glycosylated apigenin (vitexin) biosynthesis in Ficus deltoidea based on plant proteins identified by LC-MS/MS. Front. Biol., 2017, 12(6): 448‒458 https://doi.org/10.1007/s11515-017-1472-0

References

[1]
Adam Z, Khamis  S, Ismail A ,  Hamid M  (2012). Ficus deltoidea: A potential alternative medicine fordiabetes mellitus. Evid Based ComplementAlternat Med, 2012: 632763
CrossRef Pubmed Google scholar
[2]
Afrin S, Huang  J J, Luo  Z Y (2015). JA-mediated transcriptionalregulation of secondary metabolism in medicinal plants. Sci Bull, 60(12): 1062–1072
CrossRef Google scholar
[3]
Akashi T, Aoki  T, Ayabe S  (2005). Molecular and biochemical characterization of 2-hydroxyisoflavanone dehydratase. Involvementof carboxylesterase-like proteins in leguminous isoflavone biosynthesis. Plant Physiol, 137(3): 882–891
CrossRef Pubmed Google scholar
[4]
Akashi T, Fukuchi-Mizutani  M, Aoki T ,  Ueyama Y ,  Yonekura-Sakakibara K ,  Tanaka Y ,  Kusumi T ,  Ayabe S  (1999). Molecular cloning and biochemical characterization of a novel cytochromeP450, flavone synthase II, that catalyzes direct conversion of flavanonesto flavones. Plant Cell Physiol, 40(11): 1182–1186
CrossRef Pubmed Google scholar
[5]
Akey D L, Razelun  J R, Tehranisa  J, Sherman D H ,  Gerwick W H ,  Smith J L  (2010). Crystal structures of dehydratase domains from the curacin polyketide biosyntheticpathway. Structure, 18(1): 94–105
CrossRef Pubmed Google scholar
[6]
Alejandro S, Lee  Y, Tohge T ,  Sudre D ,  Osorio S ,  Park J, Bovet  L, Lee Y ,  Geldner N ,  Fernie A R ,  Martinoia E  (2012). AtABCG29 is a monolignol transporter involved in lignin biosynthesis. Curr Biol, 22(13): 1207–1212
CrossRef Pubmed Google scholar
[7]
Austin M B, Noel  J P (2003). The chalcone synthase superfamily of type III polyketide synthases. Nat Prod Rep, 20(1): 79–110
CrossRef Pubmed Google scholar
[8]
Azemin A, Dharmaraj  S, Hamdan M R ,  Mat N, Ismail  Z, Khamsah S M  (2014). Discriminating Ficus deltoidea var. bornensis from Different Localities by HPTLC and FTIR Fingerprinting. J Appl Pharm Sci, 4: 69–75
[9]
Bak S, Beisson  F, Bishop G ,  Hamberger B ,  Höfer R ,  Paquette S  (2011). Cytochromes P450. Arab B, e0144 
CrossRef Google scholar
[10]
Bednar R A, Hadcock  J R (1988). Purification and characterization of chalcone isomerasefrom soybeans. J Biol Chem, 263(20): 9582–9588
Pubmed
[11]
Bernhoft A, Siem  H, Bjertness E ,  Meltzer M ,  Flaten T ,  Holmsen E  (2010). Bioactive compounds in plants–benefits and risks for man and animals. in Proceedings from a Symposium Held at The Norwegian Academy of Science and Letters,Novus forlag, Oslo
[12]
Bradford M M (1976). A rapid and sensitive method forthe quantitation of microgram quantities of protein utilizing theprinciple of protein-dye binding. Anal Biochem, 72(1-2): 248–254
CrossRef Pubmed Google scholar
[13]
Brazier-Hicks M, Edwards  R (2013). Metabolic engineering of the flavone-C-glycoside pathwayusing polyprotein technology. Metab Eng, 16: 11–20
CrossRef Pubmed Google scholar
[14]
Brazier-Hicks M, Evans  K M, Cunningham  O D, Hodgson  D R W, Steel  P G, Edwards  R (2008). Catabolism of glutathioneconjugates in Arabidopsis thaliana. Role in metabolic reactivation of the herbicide safener fenclorim. J Biol Chem, 283(30): 21102–21112
CrossRef Pubmed Google scholar
[15]
Brazier-Hicks M, Evans  K M, Gershater  M C, Puschmann  H, Steel P G ,  Edwards R  (2009). The C-glycosylation of flavonoids in cereals. J Biol Chem, 284(27): 17926–17934
CrossRef Pubmed Google scholar
[16]
Bungaruang L, Gutmann  A, Nidetzky B  (2013). Leloir glycosyltransferases and natural product glycosylation: Biocatalyticsynthesis of the C-glucoside nothofagin, a major antioxidant of redbushherbal tea. Adv Synth Catal, 355(14-15): 2757–2763
CrossRef Pubmed Google scholar
[17]
Cheng H, Li  L, Cheng S ,  Cao F, Wang  Y, Yuan H  (2011). Molecular cloning and function assay of a chalcone isomerase gene (GbCHI) from Ginkgo biloba. Plant Cell Rep, 30(1): 49–62
CrossRef Pubmed Google scholar
[18]
Choo C Y, Sulong  N Y, Man  F, Wong T W  (2012). Vitexin and isovitexin from the Leaves of Ficus deltoidea with in-vivo α-glucosidase inhibition. J Ethnopharmacol, 142(3): 776–781
CrossRef Pubmed Google scholar
[19]
Courts F L, Williamson  G (2015). Critical Reviews in Food Science and Nutrition The occurrence,fate and biological activities of C- glycosyl flavonoids in the humandiet. Crit Rev Food Sci Nutr, 55(10): 1352–1367
CrossRef Pubmed Google scholar
[20]
Crosby K C, Pietraszewska-Bogiel  A, Gadella T W J  Jr,  Winkel B S J  (2011). Förster resonance energy transfer demonstrates a flavonoid metabolon in livingplant cells that displays competitive interactions between enzymes. FEBS Lett, 585(14): 2193–2198
CrossRef Pubmed Google scholar
[21]
Crozier A, Jaganath  I B, Clifford  M N (2009). Dietary phenolics: chemistry, bioavailability and effects on health. Nat Prod Rep, 26(8): 1001–1043
CrossRef Pubmed Google scholar
[22]
Day A J, Gee  J M, DuPont  M S, Johnson  I T, Williamson  G (2003). Absorption of quercetin-3-glucoside and quercetin-4′-glucoside in the ratsmall intestine: the role of lactase phlorizin hydrolase and the sodium-dependentglucose transporter. Biochem Pharmacol, 65(7): 1199–1206 
CrossRef Pubmed Google scholar
[23]
Dey S, Corina Vlot  A (2015). Ethylene responsive factors in the orchestration ofstress responses in monocotyledonous plants. Front Plant Sci, 6: 640
CrossRef Pubmed Google scholar
[24]
Dixon D P, Hawkins  T, Hussey P J ,  Edwards R  (2009). Enzyme activities and subcellular localization of members of the Arabidopsis glutathione transferasesuperfamily. J Exp Bot, 60(4): 1207–1218
CrossRef Pubmed Google scholar
[25]
Du Y, Chu  H, Chu I K ,  Lo C (2010a). CYP93G2 is a flavanone 2-hydroxylase required for C-glycosyl-flavonebiosynthesis in rice. Plant Physiol, 154(1):324–33
[26]
Du Y, Chu  H, Wang M ,  Chu I K ,  Lo C (2010b). Identificationof flavone phytoalexins and a pathogen-inducible flavone synthaseII gene (SbFNSII) in sorghum. J Exp Bot, 61(4): 983–994
CrossRef Pubmed Google scholar
[27]
Dürr C, Hoffmeister  D, Wohlert S E ,  Ichinose K ,  Weber M ,  Von Mulert U ,  Thorson J S ,  Bechthold A  (2004). The glycosyltransferase UrdGT2 catalyzes both C- andO-glycosidic sugar transfers. Angew Chem Int Ed Engl, 43(22): 2962–2965
CrossRef Pubmed Google scholar
[28]
Dzolin S, Ahmad  R, Zain M M ,  Ismail M I  (2015). Flavonoid distribution in four varieties of Ficus deltoidea (Jack). J Med Plant Herb Ther Res, 3: 1–9
[29]
El Amrani A, Barakate  A, Askari B M ,  Li X, Roberts  A G, Ryan  M D, Halpin  C (2004). Coordinate expression and independentsubcellular targeting of multiple proteins from a single transgene. Plant Physiol, 135(1): 16–24
CrossRef Pubmed Google scholar
[30]
Falcone Ferreyra M L ,  Rodriguez E ,  Casas M I ,  Labadie G ,  Grotewold E ,  Casati P  (2013). Identification of a bifunctional maize C- and O-glucosyltransferase. J Biol Chem, 288(44): 31678–31688
CrossRef Pubmed Google scholar
[31]
Farsi E, Shafaei  A, Hor S Y ,  Ahamed M B K ,  Fei M, Attitalla  I H (2011). Correlation between enzymes inhibitory effects and antioxidant activities of standardizedfractions of methanolic extract obtained from Ficus deltoidea leaves. Afr J Biotechnol, 10(67): 15184–15194
CrossRef Google scholar
[32]
François I E J A ,  Van Hemelrijck W ,  Aerts A M ,  Wouters P F J ,  Proost P ,  Broekaert W F ,  Cammue B P A  (2004). Processing in Arabidopsis thaliana of a heterologous polyprotein resulting indifferential targeting of the individual plant defensins. Plant Sci, 166(1): 113–121
CrossRef Google scholar
[33]
Ha S H, Liang  Y S, Jung  H, Ahn M J ,  Suh S C ,  Kweon S J ,  Kim D H ,  Kim Y M ,  Kim J K  (2010). Application of two bicistronic systems involving 2Aand IRES sequences to the biosynthesis of carotenoids in rice endosperm. Plant Biotechnol J, 8(8): 928–938
CrossRef Pubmed Google scholar
[34]
Hakamatsuka T, Mori  K, Ishida S ,  Ebizuka Y ,  Sankawa U  (1998). Purification of 2-hydroxyisoflavanone dehydratase from the Cell Cultures of Pueraria lobata. Phytochemistry, 49(2): 497–505
CrossRef Google scholar
[35]
Halpin C, Cooke  S E, Barakate  A, El Amrani A ,  Ryan M D  (1999). Self-processing 2A-polyproteins--a system for co-ordinate expression of multiple proteinsin transgenic plants. Plant J, 17(4): 453–459
CrossRef Pubmed Google scholar
[36]
Hasegawa K, Cowan  A B, Nakatsuji  N, Suemori H  (2007). Efficient multicistronic expression of a transgene inhuman embryonic stem cells. Stem Cells, 25(7): 1707–1712
CrossRef Pubmed Google scholar
[37]
He M, Min  J W, Kong  W L, He  X H, Li  J X, Peng  B W (2016). A review on the pharmacological effectsof vitexin and isovitexin. Fitoterapia, 115: 74–85
CrossRef Pubmed Google scholar
[38]
Hicks M A, Barber  A E 2nd, Giddings  L A, Caldwell  J, O’Connor S E ,  Babbitt P C  (2011). The evolution of function in strictosidine synthase-like proteins. Proteins, 79(11): 3082–3098
CrossRef Pubmed Google scholar
[39]
Isaacson T, Damasceno  C M B, Saravanan  R S, He  Y, Catalá C ,  Saladié M ,  Rose J K  (2006). Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc, 1(2): 769–774
CrossRef Pubmed Google scholar
[40]
Ishihara A, Ogura  Y, Tebayashi S ,  Iwamura H  (2002). Jasmonate-induced changes in flavonoid metabolism inbarley (Hordeum vulgare) leaves. Biosci Biotechnol Biochem, 66(10): 2176–2182
CrossRef Pubmed Google scholar
[41]
Ishikawa F, Haushalter  R W, Burkart  M D (2012). Dehydratase-specific probes for fatty acid and polyketide synthases. J Am Chem Soc, 134(2): 769–772
CrossRef Pubmed Google scholar
[42]
Jiménez C R ,  Huang L ,  Qiu Y, Burlingame  A L (2001). Searching sequence databases overthe internet: protein identification using MS-Fit. Curr Protoc Protein Sci, Chapter 16: 5
Pubmed
[43]
Kaltenbach M, Schröder  G, Schmelzer E ,  Lutz V, Schröder  J (1999). Flavonoid hydroxylase from Catharanthus roseus: cDNA,heterologous expression, enzyme properties and cell-type specificexpression in plants. Plant J, 19(2): 183–193
CrossRef Pubmed Google scholar
[44]
Kašparová M ,  Siatka T  (2014). Production of flavonoids and isoflavonoids in jasmonic acid-induced red clover suspension cultures. Ceska Slov Farm, 63(1): 17–21
Pubmed
[45]
Kerscher F, Franz  G (1987). Biosynthesis of Vitexin and Isovitexin : Enzymatic Synthesis of theC-Glucosylflavones Vitexin and Isovitexin with an Enzyme Preparationfrom Fagopyrum esculentum M. Seedlings. Z Naturforsch C, 42: 519–524
[46]
Kramell R, Miersch  O, Atzorn R ,  Parthier B ,  Wasternack C  (2000). Octadecanoid-derived alteration of gene expression andthe “oxylipin signature” in stressed barley leaves. Implicationsfor different signaling pathways. Plant Physiol, 123(1): 177–188
CrossRef Pubmed Google scholar
[47]
Laemmli U K (1970). Cleavage of structural proteins duringthe assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259): 680–685
CrossRef Pubmed Google scholar
[48]
Le Roy J, Huss  B, Creach A ,  Hawkins S ,  Neutelings G  (2016). Glycosylation Is a Major Regulator of Phenylpropanoid Availability and BiologicalActivity in Plants. Front Plant Sci, 7: 735
CrossRef Pubmed Google scholar
[49]
Li Y, Dodge  G J, Fiers  W D, Fecik  R A, Smith  J L, Aldrich  C C (2015). Functional Characterization of aDehydratase Domain from the Pikromycin Polyketide Synthase. J Am Chem Soc, 137(22): 7003–7006
CrossRef Pubmed Google scholar
[50]
Luley-Goedl C, Nidetzky  B (2011). Glycosides as compatible solutes: biosynthesis and applications. Nat Prod Rep, 28(5): 875–896
CrossRef Pubmed Google scholar
[51]
Lussier F X, Colatriano  D, Wiltshire Z ,  Page J E ,  Martin V J J  (2013). Engineering microbes for plant polyketide biosynthesis. Comput Struct Biotechnol J, 3(4): e201210020
CrossRef Pubmed Google scholar
[52]
Martens S, Mithöfer  A (2005). Flavones and flavone synthases. Phytochemistry, 66(20): 2399–2407
CrossRef Pubmed Google scholar
[53]
Mierziak J, Kostyn  K, Kulma A  (2014). Flavonoids as important molecules of plant interactions with the environment. Molecules, 19(10): 16240–16265
CrossRef Pubmed Google scholar
[54]
Misbah H, Aziz  A A, Aminudin  N (2013). Antidiabetic and antioxidant properties of Ficus deltoidea fruit extracts and fractions. BMC Complement Altern Med, 13(1): 118
CrossRef Pubmed Google scholar
[55]
Mizutani M, Sato  F (2011). Unusual P450 reactions in plant secondary metabolism. Arch Biochem Biophys, 507(1): 194–203
CrossRef Pubmed Google scholar
[56]
Mohd K S, Rosli  A S, Azemin  A, Mat N ,  Zakaria A J  (2016). Comprehensive Biological Activities Evaluation and Quantification of Marker Compoundsof Ficus deltoiea Jack Varieties. Int J Pharmacogn Phytochem Res, 8: 1698–1708
[57]
Morant M, Bak  S, Møller B L ,  Werck-Reichhart D  (2003). Plant cytochromes P450: tools for pharmacology, plant protection and phytoremediation. Curr Opin Biotechnol, 14(2): 151–162
CrossRef Pubmed Google scholar
[58]
Nagatomo Y, Usui  S, Ito T ,  Kato A, Shimosaka  M, Taguchi G  (2014). Purification, molecular cloning and functional characterization of flavonoid C-glucosyltransferases from Fagopyrum esculentum M. (buckwheat) cotyledon. Plant J, 80(3): 437–448
CrossRef Pubmed Google scholar
[59]
Pauwels L, Inzé  D, Goossens A  (2009). Jasmonate-inducible gene: What does it mean? Trends Plant Sci, 14(2): 87–91
CrossRef Pubmed Google scholar
[60]
Praveena R, Sadasivam  K, Kumaresan R ,  Deepha V ,  Sivakumar R  (2013). Experimental and DFT studies on the antioxidant activityof a C-glycoside from Rhynchosia capitata. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 103: 442–452
CrossRef Pubmed Google scholar
[61]
Rawat P, Kumar  M, Sharan K ,  Chattopadhyay N ,  Maurya R  (2009). Ulmosides A and B: flavonoid 6-C-glycosides from Ulmus wallichiana, stimulatingosteoblast differentiation assessed by alkaline phosphatase. Bioorg Med Chem Lett, 19(16): 4684–4687
CrossRef Pubmed Google scholar
[62]
Saito K, Yonekura-Sakakibara  K, Nakabayashi R ,  Higashi Y ,  Yamazaki M ,  Tohge T ,  Fernie A R  (2013). The flavonoid biosynthetic pathway in Arabidopsis: structural and genetic diversity. Plant Physiol Biochem, 72: 21–34
CrossRef Pubmed Google scholar
[63]
Schaller F (2001). Enzymes of the biosynthesis of octadecanoid-derivedsignalling molecules. J Exp Bot, 52(354): 11–23
CrossRef Pubmed Google scholar
[64]
Shafaei A, Farsi  E, Ismail Z ,  Asmawi M Z  (2012). Quantitative High Performance Thin-Layer ChromatographyMethod for Analysis of Vitexin and Isovitexin in Extracts of Leavesof Ficus deltoidea. Asian J Chem, 24: 2286
[65]
Shevchenko A, Tomas  H, Havlis J ,  Olsen J V ,  Mann M (2006). In-geldigestion for mass spectrometric characterization of proteins andproteomes. Nat Protoc, 1(6): 2856–2860
CrossRef Pubmed Google scholar
[66]
Stafford H A (1991). Flavonoid evolution: an enzymic approach. Plant Physiol, 96(3): 680–685
CrossRef Pubmed Google scholar
[67]
University of California (2017). Ms-Fit. Available at: http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msfitstandard.
[68]
Väisänen E E ,  Smeds A I ,  Fagerstedt K V ,  Teeri T H ,  Willför S M ,  Kärkönen A  (2015). Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotianabenthamiana seedlings. Planta, 242(3): 747–760
CrossRef Pubmed Google scholar
[69]
Wu J, Zaleski  T J, Valenzano  C, Khosla C ,  Cane D E  (2005). Polyketide double bond biosynthesis. Mechanistic analysis of thedehydratase-containing module 2 of the picromycin/methymycin polyketidesynthase. J Am Chem Soc, 127(49): 17393–17404
CrossRef Pubmed Google scholar
[70]
Xiao J, Capanoglu  E, Jassbi A R ,  Miron A  (2016). Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr, 56(sup1 Suppl 1): S29–S45
CrossRef Pubmed Google scholar
[71]
Xiao J, Chen  T, Cao H  (2015). Flavonoid glycosylation and biological benefits. Biotechnol Adv, 
CrossRef Pubmed Google scholar
[72]
Xu F, Li  L, Zhang W ,  Cheng H ,  Sun N, Cheng  S, Wang Y  (2012). Isolation, characterization, and function analysis of a flavonolsynthase gene from Ginkgo biloba. Mol Biol Rep, 39(3): 2285–2296
CrossRef Pubmed Google scholar
[73]
Yang C Q, Fang  X, Wu X M ,  Mao Y B ,  Wang L J ,  Chen X Y  (2012). Transcriptional regulation of plant secondary metabolism. J Integr Plant Biol, 54(10): 703–712
CrossRef Pubmed Google scholar
[74]
Yonekura-Sakakibara K ,  Hanada K  (2011). An evolutionary view of functional diversity in family1 glycosyltransferases. Plant J, 66(1): 182–193
CrossRef Pubmed Google scholar
[75]
Yonekura-Sakakibara K ,  Tohge T ,  Matsuda F ,  Nakabayashi R ,  Takayama H ,  Niida R ,  Watanabe-Takahashi A ,  Inoue E ,  Saito K  (2008). Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leadingto decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis. Plant Cell, 20(8): 2160–2176
CrossRef Pubmed Google scholar
[76]
Zhai R, Wang  Z, Zhang S ,  Meng G, Song  L, Wang Z ,  Li P, Ma  F, Xu L  (2016). Two MYB transcription factors regulate flavonoid biosynthesis inpear fruit (Pyrus bretschneideri Rehd.). J Exp Bot, 67(5): 1275–1284
CrossRef Pubmed Google scholar
[77]
Zhang X, Abrahan  C, Colquhoun T A ,  Liu C and Sciences A (2017). A proteolytic regulator controlling chalcone synthasestability and flavonoid biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell Online, tpc-00855
CrossRef Google scholar
[78]
Zhao J, Davis  L C, Verpoorte  R (2005). Elicitor signal transductionleading to production of plant secondary metabolites. Biotechnol Adv, 23(4): 283–333
CrossRef Pubmed Google scholar
[79]
Zunoliza A, Khalid  H, Zhari I ,  Rasadah M A  (2009). Anti-inflammatory activity of standardised extractsof leaves of three varieties of Ficus deltoidea. Int J Pharm Clin Res, 1: 100–105

Acknowledgements

The authors would like to thank theMinistry of Higher Education for their financial support under theHiCoE grant (4J263) to carry out this project.

Compliance with ethics guidelines

Farah Izana Abdullah, Lee Suan Chua,and Zaidah Rahmat declare that they have no conflicts of interest.

RIGHTS & PERMISSIONS

2017 Higher Education Press and Springer-Verlag GmbH Germany, part of Springer Nature
PDF(552 KB)

Accesses

Citations

Detail

Sections
Recommended

/